生物技術論文酶在皮革工業應用

　　由于酶具有天然、安全和對環境友好等特點，可在皮革行業中替代化學產品。然而，酶的應用成本仍然很高，并且酶在皮革行業中的應用技術還需要更深入研究。在這篇生物技術論文中，展示了微生物酶的篩選分離過程、微生物的培養和酶的特性，對以后的研究會有所幫助。《皮革與化工》是中國科技核心期刊。入編《中國期刊網》、《中國學術期刊(光盤版)》，為《中文科技期刊數據庫》收錄期刊，《萬方數據-數字化期刊群》全文上網期刊，《美國化學文摘(CA)》摘錄期刊。是刊登制革領域里皮革、合成革及其化工材料的專業性技術期刊;重點報道國內外制革工藝及皮革化工方面的新技術、新工藝、新產品，并密切關注國內外制革技術發展動態。

　　1生物技術

　　生物技術就是運用生物處理知識和生物體的特性來解決問題和制造有用的產品。能夠使用生物制劑(有機物、細胞、細胞器、分子)來獲得所需要的產品或者提供服務的知識稱為生物技術，包括基礎科學(分子生物學、微生物學、細胞生物學、遺傳性、基因組學、胚胎學)，應用科學(免疫學、化學和生物化學技術)和其它技術(計算機技術、機器人技術和過程控制技術)。生物技術影響不同的生產領域，提供了新的就業機會，提供了植物抗病，生產生物降解塑料、生物燃料，對環境少污染的工農業生產和環境生物治理的方法。目前，在工業上使用生物技術方法(生物催化和生物轉化)有所增加。經濟合作與發展組織研究也表明生物技術在工業上的應用增加。在案例研究中，70%以上使用了酶法工藝，從而使費用降低了9%~90%，并且節省了自然資源。

　　2酶

　　酶是有機物質，一般稱為催化多種化學反應的生物催化劑的蛋白質，酶廣泛應用于洗滌劑、食品、醫藥、精細化工等行業。它們是制得重視的物質，其顯著的高效性和催化能力，明顯優于合成催化劑。高特異性的酶取決于它的尺寸和產生與底物親和區的三維構象。從巴斯德以來的研究表明，盡管和其他物質同樣受到自然法則的支配，酶在一些重要方面卻不同于普通化學催化劑，具體包括如下幾個方面：更快的反應速度，溫和的反應條件，特異性強和可調控能力。幾乎所有的細胞代謝反應都是在酶的催化下進行的，這些反應是所有生物體代謝的基礎，為工業生物催化更高效和經濟提供了極大可能。現有的酶種類估計有6000~7000種，其中3000種酶具有生物學功能，但是應用于工業中的酶僅有130種左右，或為游離酶，或作為細胞的一部分。由于微生物酶比同種來自植物或動物的酶更穩定，因此大部分工業用酶源于微生物。至少有3000種酶是由嗜溫微生物分離得到的。酶的分類如表1所示。

　　2.1酶的應用

　　酶的應用與全球市場有明顯的關聯，可以分為工業用酶和醫用酶\分析酶和科技用酶。在生物科技領域內，尤其是工業用酶作為最主要的應用酶。過去十年，與科學和技術密切相關的酶的應用變得包羅萬象很難對它準確定義。然而，如圖2所示，生物技術無疑包括微生物學、生物化學、基因工程以及材料的化學及生物化學處理過程。在這些使用的制劑中，酶常常用來改善工藝，并且使新原料得以使用，從而提高它們的物理和化學特性。酶的應用非常廣泛，在食品、農業、造紙、皮革和紡織工業等行業的應用顯著節約了成本。有作者認為，酶的應用是工業可持續發展的重要組成部分。生物治療技術需要使用生物制劑(例如：活的微生物或酶)對被環境中污染物的污染進行去除、轉化或去毒，通過自然過程將污染物轉化為毒性較低的物質形式。2.1.1酶在皮革清潔化生產中的應用生物技術在制革業的中應用已經有很多年了，但是大部分酶制劑在這一領域沒有足夠的特異性。

　　目前，生物方法在浸水、脫毛、軟化和脫脂過程中取得了一定的成功。在浸水、脫毛或浸灰過程中用酶取代化學品和電力這一小“投資”，能夠相當大的節約能源和減少二氧化碳的排放量。也選用生物技術處理廢水和固體蛋白廢物。在皮革生產過程中的浪費高達50%。最好的清理方法是恢復具有商業用途的蛋白質的可溶性。酶可降解未鞣制的和鞣制的皮革固體廢棄物。

　　酶在原料皮加工過程的應用如下：(1)蛋白酶蛋白酶是水解蛋白質和肽的一類酶。堿性蛋白酶最初作為洗滌劑的添加劑，是具有生理和商業價值的一類酶。在蛋白質的水解和裂解中扮演著特殊的角色。芽孢桿菌是堿性蛋白酶的主要來源，廣泛應用于各行業。堿性蛋白酶的生產一般采用液態培養。每種微生物在其特定的條件下有酶的最大產值。堿性蛋白酶能夠通過催化水解破壞蛋白質的肽鍵和清除清蛋白和球蛋白等非纖維蛋白。目前已嘗試設計一種不浸酸環保型植物鞣法，使用蛋白水解酶來提高植物丹寧的利用率。這一方法使丹寧的利用率超過95%，比傳統的植物鞣法提高了10%。酸性蛋白酶用于幫助植物鞣劑擴散，達到更好的利用。在皮革的抗張強度和延伸性方面，傳統生產和酶法生產沒有明顯的區別。(2)角蛋白酶角蛋白是生皮、頭發、羊毛、指甲和羽毛的主要結構蛋白。在表皮和骨骼組織蛋白質形成剛性纖維。羽毛中包含90%以上的角蛋白。角蛋白酶在生物技術工程中有很多應用：可用于原料皮脫毛，洗滌劑和肥料的生產，動物飼料和化妝品，工業廢棄物的降解和生產可生物降解的薄膜。動物和植物不能有效的水解角蛋白。角蛋白是一種非常穩定蛋白質，但是某些真菌、細菌和放線菌在細胞內外產生的角蛋白酶可催化其水解。有關分析表明，角蛋白酶可作用許多可溶性和不可溶性的蛋白底物。(3)脂肪酶目前大部分脂肪酶來源于真菌和酵母菌，但是細菌脂肪酶和來自于其他微生物的脂肪酶在高溫和惡劣條件下更為穩定而量在增長。主要來源于微生物的脂肪酶催化水解甘油三酸酯為游離脂肪酸和甘油。研究了用黑曲霉生產脂肪酶，并且測得了細胞外脂肪酶的特性(最佳pH和溫度，穩定性和去除橄欖油的能力)。脂肪酶可溶于水并且在消化代謝中扮演著重要的角色。在皮革生產中，脂肪酶作用于脂肪、肉的脂類、油脂和皮腺產生的油。脂肪酶用于脫脂和脫毛過程。脂肪酶與表面活性劑使用脫脂效果更好。當脂肪酶和蛋白酶結合用于復鞣、去除油脂和污垢，皮革可能獲得更為均勻和鮮艷的顏色。使用脂肪酶能夠減少皮本身油脂脂肪帶來的色花，減少皺紋和其它類型的變色。

　　(4)淀粉酶淀粉酶可使淀粉分子降解并且在自然界中分布很廣。淀粉酶在工業上有很重要的生物技術應用，比如在紡織、紙漿和紙、皮革、洗滌劑、啤酒、面包、嬰幼兒谷類食品、飼料、化工和制藥業以及淀粉的液化和糖化等方面的應用。這些酶來源廣泛，可從植物、動物和微生物獲得，通常微生物酶的工業需求最大。大部分微生物淀粉酶可作為商業用途和水解淀粉。在皮革生產中，淀粉酶常常用來打開皮革的纖維結構。(5)膠原酶膠原酶來源廣泛，是一種金屬蛋白酶。膠原酶的動力學模型取決于它們的來源。在-Gly-Pro-X-Gly-Pro-X序列中，細菌膠原酶優先打開Gly-X鍵(X是一種天然氨基酸)。鞣制后的膠原蛋白(用鞣劑交聯)有抗膠原酶的作用;這種酶不能水解鉻鞣皮革，但能打開皮革的纖維結構。已有研究表明膠原酶來源于幾種微生物，但對降解和水解主要由膠原蛋白組成的皮革很困難。細菌膠原酶應用于皮革染色。使用這種酶能夠獲得更柔軟的皮革，并且保持變皮革的強度不變。表2總結了一些酶在皮革生產中的應用。2.1.2在皮革生產中酶的活性評估在皮革生產過程中，除了掌握不同特性的酶在皮革生產多方面的應用，定量評估酶對原皮的作用也非常重要。最新文獻探討了用光學顯微鏡或/和電子顯微鏡對蛋白質、原纖維蛋白(葡萄胺多糖和蛋白聚糖)、羥脯氨酸的定量測定，以及評估粒面質量。酶促反應的效果決定成品革的力學強度。葡萄胺多糖又稱粘多糖，是由糖醛酸和六亞甲基四胺(葡萄糖胺或半乳糖胺)聚合而成的線性高分子碳水化合物。最常見的葡萄糖胺是透明質酸。

　　硫酸皮膚素在準備工段被部分去除，它與打開纖維結構密切相關。有效去除硫酸皮膚素有利于打開纖維結構便于化學品滲透，并提高得革率;但是過量的去除硫酸皮膚素會導致皮革松面和強度差。蛋白多糖是一種結合在葡萄糖胺上的細胞外蛋白。主要的蛋白多糖是核心蛋白聚糖，由單鏈的硫酸皮膚素和多肽鏈組成。有效的去除蛋白多糖對提高皮革的柔軟性和柔韌性非常重要。去除纖維間質如蛋白多糖和氨基多糖是傳統制革浸灰和軟化過程的前提。用蛋白酶軟化皮革有利于去除纖維間質。一些學者研制了一套方法來判定浸灰和軟化過程中這些蛋白質的去除情況。這些方法包括根據標準濃度曲線，通過計算硫酸軟骨素的濃度來確定葡萄糖胺的濃度，由粘蛋白的量確定蛋白多糖的濃度。羥脯氨酸是膠原中特有的一種氨基酸，在其他蛋白質中不曾發現。在膠原結構中最常見的氨基酸有羥脯氨酸(11.28%)，脯氨酸(11.77%)，甘氨酸(33.43%)，丙氨酸(11.97%)和精氨酸(5.04%)。哺乳動物的皮中每100g膠原中含有13.45g羥脯氨酸，然而魚皮中每100g膠原中含有7~9g羥脯氨酸�；�于此，在皮革生產過程中，根據羥脯氨酸的含量用來確定原料皮的膠原含量和生產過程中不希望釋放的膠原量。除了分析纖維間質，還可通過皮革的抗張強度、延伸率和撕裂強度來評估酶在皮革生產中各工序的應用效果。

　　2.2微生物酶的分離和篩選

　　搜索一種新的酶始于自然界中的微生物。研究者從熱帶森林到冰川地區收集不同氣候條件下的土壤樣品并對其進行檢測。酶的獲取途徑非常廣泛。大部分酶主要來源于動物、植物和微生物。大部分工業用酶來自于微生物。微生物酶比來自于動植物的酶在數量上更有優勢。這些優勢主要表現于：a.微生物比動物和植物生長更快。b.酶僅僅是動植物體很微小的一部分。因此，酶的大規模生產需要大片的土地和大量的動物。這種限制使得動植物酶非常昂貴。微生物酶不受這些方面的約束，想生產多少就能生產多少。c.微生物酶比動植物酶更穩定。d.由于微生物在自然界中種類的多樣性，因此最大的優勢就是能夠生產各種類型的酶。

　　e.基于對微生物基因基礎的研究和了解從而控制其生理功能，可以人為操縱微生物產生某些代謝產物，包括酶。在酶的生產中，第一步就是分離和篩選微生物，也就是分離特定的菌株從而獲得所需要的酶，如圖3所示。為了達到要求，需要對不同的菌株進行精細選擇和測試以鑒定這些菌株，從而獲得所需特性的菌株。目前，已經開始研究幾種新型酶。外來微生物(比如極端微生物)是酶的重要來源。生物體以pH值的不同而分布不同。眾所周知微生物接近中性的pH條件下繁殖。當偏離接近中性條件時，微生物的數量減少。標準做法就是將許多微生物置于大量含有培養基和瓊脂平板上培養，如圖4所示。分離微生物的典型方法就是使用后續金屬保護層，篩選理想特性的微生物。然后，微生物在特種媒介中生長，使用合適的基質如脫脂牛奶或酪蛋白、淀粉、三丁酸甘油酯或黃油來測定蛋白的水解和脂肪的分解活力。選擇那些分離出來的具有很強活力的菌株，然后用恰當的方法保存備用。生產應用于皮革生產用酶(包括蛋白酶，角蛋白酶，膠原酶)的微生物，可根據各種微生物棲息地如制革廠的污泥、廢棄物和污水中分離出來。Ogino等分離出來的76種微生物能夠在中性pH條件下降解制革廢水，23種微生物能在堿性條件下降解制革廢棄物。文獻中通常使用含有瓊脂和蛋白質的培養基來獲得蛋白水解酶。最常用的蛋白有酪蛋白，脫脂牛奶和磨碎的羽毛。蛋白水解活性檢測是通過底物消耗在周圍出現一個透明環，就表示有蛋白酶產生。

　　2.3酶的生產和微生物的營養大部分酶通過水中培養獲得，但有些酶通過半固體培養基生產。

　　2.3.1半固體培養基這種類型的培養基通常用于真菌微生物培養，在低濕度和通風性良好的條件下能夠獲得較高的酶產量。通過空氣循環的方式將溫度維持在30℃左右。生產周期一般為30~40h，但有時會持續長達7d。最佳產量取決于抽樣和對酶產量的評估。2.3.2水基培養大多數酶的生產是在生物反應器中通過水基培養來實現的。該培養基包含足夠的碳源、氮源、金屬和微量元素等微生物生長所必須的營養物。然而，在某些情況下適宜微生物生長的培養基并不有利于所需酶的生產。溫度和pH值必須適合每種生物體。酶的生長、酶的生產以及酶的穩定性所需的溫度和pH值，每種酶都不盡相同。培養溫度通常由三個因素決定。如果微生物生產酶是需氧的，則氧氣需氧量較大，因此水基培養中需要通氣和攪拌。微生物必須在適宜條件下培養才能夠提高酶的產量。提高蛋白酶產量和有助于細胞生長的培養條件明顯不同。在堿性蛋白酶的工業化生產中，需要高濃度的復雜碳水化合物、蛋白質和其他培養基組分。為了開發一種經濟又切實可行的技術，研究者在以下幾個方面展開了研究：(a)提高堿性蛋白酶的利用率;(b)最佳生產條件;(c)使用廉價的培養基。在大多數生物體中，有機和無機氮源會代謝產生氨基酸、核酸、蛋白質和其他細胞組分。

　　堿性蛋白酶中氮含量高達15.6%，并且它們的生產取決于培養基中碳源和氮源的供應。雖然復雜的氮源通常用于堿性蛋白酶的生產，不同的生物體對氮源的需求量也不同。有研究者發現，當糖(如乳糖、麥芽糖、蔗糖和果糖)用于微生物的培養時，堿性蛋白酶的產量會提高。各種有機酸(如醋酸、乙酸甲酯、檸檬酸或檸檬酸鈉)有利于堿性蛋白酶的生產。在某些情況下，酶的生產需要二價金屬離子(鈣、鈷、硼、鐵、鎂、錳)。在大多數研究中，鉀的來源主要是磷酸鉀。磷酸鹽用作培養基的緩沖劑，但是過量會抑制細胞的生長和酶的產生。總之，微生物和其他生物一樣需要營養物質。以下是影響微生物營養最重要的因素。真菌和大多數細菌均為化能自養型微生物，通過適宜底物的氧化反應來獲取能量。無機營養微生物氧化無機化合物來獲得營養，而有機營養菌氧化有機化合物獲得營養。第一組中包括氧化硫產生硫酸的細菌。第二組包括真菌和相當數量的細菌。2.3.3碳源對于自養型微生物來說，主要碳源是二氧化碳和碳酸氫鈉，能夠以此合成機體所需要的全部有機組分。大多數細菌為異養型，需要有機碳源;有機碳源一般有碳水化合物、氨基酸、脂類、醇類和淀粉及纖維素類聚合物。實際上，一些微生物能夠利用一些天然有機物和人工合成的化合物。

　　微生物的多用途性非常重要，使微生物的應用更廣泛地向有利的方向轉變。2.3.4氮源微生物對氮的需求分為三類。一些細菌可直接吸收大氣中的氮并轉化為有機氮。許多真菌和細菌幾乎完全使用無機氮化合物特別是銨鹽，偶爾也使用硝酸鹽。真菌和一些細菌需要以各種氨基酸為代表的有機氮源的氮。通常，蛋白質的水解或和氨基酸能夠促進大多數異養微生物的生長。2.3.5重要的無機離子除了碳和氮，微生物還需要大量無機化合物中的其他元素。一些稱為大量元素，機體需求量很大，另外一些稱為微量元素，機體需求量很少。大量元素中的磷一般以磷酸鹽形式存在，對機體的能量代謝和核酸的合成非常重要;硫是合成氨基酸(比如半胱氨酸)和維生素(比如維生素H和維生素B1)所必需的;鉀作為酶的激活劑和滲透壓的調節劑;鉀是孢子形成中重要的胞外酶的激活劑;鐵是合成某種細胞色素和顏料所必需的。由于微量元素的研究很困難，所以微量元素的作用并不確切。然而，在一些特例中證實銅、鈷、鋅、猛、鈉、硼以及其它微量元素是微生物生長所必需的元素。2.3.6生長因子生長因子是特殊生物體不可缺少的，且其自身不能合成的有機化合物。生長因子必須在培養基中才能促使有機體的生長。許多生長因子是維生素，尤其是維生素B類，也有些生長因子是氨基酸和脂肪酸。2.3.7水水不是營養物質，但它對微生物生長是必須的。因為大部分營養物質是在溶液中通過細胞質的膜吸收的。由于水的比熱容高和熱調節性好，水對調節滲透壓有重要作用。3.3.8大氣中的氧和水一樣，大氣中的氧也不是營養物。微生物根據周圍游離氧的數目進行不同的生命活動;好氧菌需要游離氧，但是有些好氧菌是微需氧的，對氧的需求量很少，不能忍受正常大氣中的氧。相反，厭氧型微生物在游離氧條件下會很快死亡，然而兼性厭氧型微生物能同時在有氧和無氧條件下存活。

　　2.4酶動力學

　　酶動力學是酶學的一部分，主要研究酶促反應速率及其影響因素。酶動力學研究主要是評估酶的產量和單位時間內底物的消耗量。酶促反應可用方程(1)來表示，可分為兩個反應，一個是生成酶和底物的復合物反應，另一個是進而生成產物和酶的反應。E+S圮ES圮P+EE、S、ES和P分別代表酶、底物、酶和底物的復合物和產物。根據這個模型，當底物濃度足夠高時，酶全部轉換為酶和底物復合物的形式，第二步會受到抑制，并且隨著底物濃度的增加，反應速度不變。酶促反應速度取決于酶濃度和底物濃度。理論上，在催化、合成和裂解反應過程中同一種酶可反復利用多次。在實踐中卻受到了很多限制。酶是一種復雜而敏感的生物分子，酶所處環境的溫度、酸堿性、微量金屬離子或某些抑制劑都會影響酶活力。一些影響酶催化活力的因素如下：(1)pH值酶處于最佳pH值時，酶分子上的電荷分布和酶的催化位點都有助于酶的催化。(2)溫度大多數酶都有其最適溫度;最適溫度取決于分離出酶的微生物。

　　一些微生物的最適溫度接近室溫，這些微生物分離出來的酶在30~40℃活性最大。溫度太低，分子移動減慢導致反應速率下降;溫度太高，分子移動速度非�？�，酶很難維持其空間結構并發生變性，從而導致酶失活。溫度升高，反應速度加快，當達到最適溫度后，反應速度減慢。(3)變性維持蛋白質功能的結構遭到破壞稱為蛋白質變性。不僅僅高溫導致蛋白質變性，其他能夠破壞化學鍵的環境因素也會導致蛋白質變性。此外，極端pH值會使官能團質子化或去質子化，使酶活力喪失。洗滌劑和非極性溶劑能夠改變蛋白質的結合和相互作用，進而引發變性。在大多情況下，變性是一個不可逆過程。(4)酶的抑制作用許多物質能夠與酶可逆結合而改變其活力。眾所周知，能降低酶活力的是抑制劑。1)抑制劑不同抑制劑的作用機理不同。一些酶抑制劑結構與酶相似，與酶不反應或反應很慢。這些類型的抑制劑可分為兩類：①競爭性抑制劑這類抑制劑能競相爭奪酶分子上的活性結合位點，并且降低用于結合底物的游離酶濃度。當底物濃度升高，也就是游離酶抑制劑所占比例下降，會引發抑制活動的下降。這種抑制劑通常和底物與酶的特殊活性位點結合類似。然而，它和酶與底物結合大不同，它不發生反應。②非競爭性抑制劑非競爭性抑制劑能夠改變酶分子上的活性位點，使酶喪失催化活性。非競爭性抑制劑和底物不一樣，提高底物濃度并不能使抑制劑活性降低。2)變性假如一種抑制劑與酶不可逆結合，稱之為滅活劑/變性劑。

　　2.5酶抑制劑在原皮保藏和皮革加工中的應用

　　浴液中鹽和其他化學品的使用會干擾酶的活性，因此應在工業過程中避免此類損失。表3展示了不同化學品對酶活性的影響，由Dettmer等報導。硫酸鈉和表面活性劑對部分酶產生抑制作用。EDTA、脂肪醇、純堿和氫氧化鈣對酶的活性的影響沒有太大的差異。Dettmer等研究表明，皮革生產過程中傳統脫毛與酶脫毛過程相比，酶脫毛技術是降低生產污水污染負荷的理想選擇。酶解過程能夠降低COD、BOD、氮和硫化物的水平并且能夠大幅度的縮短加工時間，從之前的20h縮短到6h，但要準確把握酶脫毛的時間，避免對皮革造成損害。一些學者指出酶脫毛工藝能獲得與傳統脫毛工藝品質相同的皮革。這兩個工藝的皮革產品的抗張強度、撕裂強度、鉻含量與收縮溫度都基本相同。Dettmer等通過定量測定去除纖維間質來評估酶脫毛過程中酶的效率，此外，通過測定廢水中羥脯氨酸的含量評估酶對膠原蛋白的破壞作用。有人發現在脫毛過程中酶殘余的活性可回收再利用。

　　3結論和展望

　　在清潔技術的開發和應用方面皮革加工仍面臨著挑戰。從商業途徑獲得的和新近分離出來的酶的特性都很重要，由于這些特性闡明了酶的性質，可用于未來的學術研究和工業應用。通過抑制劑、最適pH值和溫度對酶活性的影響的相關專業知識的應用，得到的數據能夠提升原料皮和皮革加工過程對酶的利用。通過分析廢水中COD、BOD、氮和硫化物的含量，證實了酶用于脫毛過程大幅度降低了廢水的污染負荷。酶促過程有助于縮短加工時間，從之前的20h縮短到6h，但是時間控制不當會對皮革造成損害。酶對皮革粒面和纖維間質的作用效果可通過測定纖維間質、羥脯氨酸含量和測試皮革的抗張強度來評估�？傊�，酶在原皮保藏和皮革加工中的應用能是一項非常有前途的技術，能夠把對環境的影響降到最低，且能提高化學產品的利用率。

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