本文摘要：由于轉基因檢測標準物質既是保障轉基因定量檢測準確可靠的基本前提，也是轉基因檢測工作的核心。因此，本篇 生物技術論文 建議加強轉基因檢測標準物質的研制，研發具有自主知識產權的標準物質，以促進轉基因檢測技術和方法研究的發展，為我國轉基因生物安全
由于轉基因檢測標準物質既是保障轉基因定量檢測準確可靠的基本前提，也是轉基因檢測工作的核心。因此，本篇生物技術論文建議加強轉基因檢測標準物質的研制，研發具有自主知識產權的標準物質，以促進轉基因檢測技術和方法研究的發展，為我國轉基因生物安全監管和安全評價提供更好的物質保障�！�生物技術》(曾用刊名：生物與特產)，1991年創刊，是涉及生物工程、生物技術、微生物學及相關領域的綜合性學術刊物，報道我國生物技術研究開發及生物學相關領域的重要成果和國內外生物技術產業進展。
摘要：為了了解歐盟轉基因生物安全檢測技術發展現狀，提高我國轉基因安全監管水平。本研究根據對歐盟8家轉基因檢測相關機構現狀的調查和分析結果，闡述了轉基因檢測過程中的關鍵技術要點及歐盟的實施情況，具體包括抽樣與制樣方法，轉基因檢測方法的循環驗證與參數要求，樣品的檢測策略與實驗室環境要求，以及檢測結果的表述與不確定度評估。并結合我國轉基因生物安全檢測發展現狀，提出了開展檢測方法的實驗室聯合驗證和加強轉基因定量PCR檢測技術的研發和應用的建議。
關鍵詞：歐盟;轉基因生物;檢測技術
隨著轉基因技術的興起和快速發展，轉基因產品的安全性問題逐漸成為國際社會普遍關注的熱點和焦點[1，2]。為促進轉基因產業的健康發展，保障消費者的知情權和選擇權，世界上許多國家和地區頒布了相關的轉基因生物安全管理與標識制度[3-5]。其中，歐盟是世界上轉基因生物安全管理與標識管理制度較為嚴格和完善的地區，也是第一個提出進行閾值管理的地區[6]。為了給轉基因生物安全管理與標識制度提供技術支撐，歐盟花費龐大人力、物力和財力進行轉基因檢測技術研究。構建了完善的轉基因檢測方法循環研制實驗室網絡和轉基因檢測標準物質研制機構[7，8]。在歐洲，執行轉基因檢測的機構組成了歐洲轉基因檢測網絡實驗室(EuropeanNetworkofGMOLaboratories，ENGL)。ENGL除了進行日常檢測，還對歐盟設置在歐盟聯合研究中心(JointResearchCentre，JRC)下屬健康與消費者保護研究所(InstituteforHealthandConsumerProtection，IHCP)的歐盟轉基因食物與飼料基準實驗室(EuropeanUnionReferenceLaboratoryforGMFood&Feed，EURL-GMFF)研制和提供的轉基因檢測方法進行驗證[9，10]。
目前國際上研制的轉基因檢測標準物質和發布的轉基因檢測標準方法有一半以上來自歐盟，因此有必要對歐盟的轉基因檢測技術平臺進行分析研究。根據在歐盟聯合研究中心健康及消費者保護研究所下屬歐盟轉基因食品和飼料基準實驗室、意大利拉齊奧大區和托斯卡納大區動物預防性實驗研究院下屬轉基因檢測國家基準實驗室、翁布里亞區食品科技園(3A-PTA)內第三方食品安全檢測實驗室(Analysis)、洛迪省Tavazzano種子檢測實驗室等8家轉基因檢測相關機構(實驗室)和單位進行的調研和考察，本文重點闡述了轉基因檢測過程中的關鍵技術要點以及歐盟的實施情況。并結合我國轉基因生物安全檢測發展現狀提出相應建議，旨為我國轉基因檢測技術的發展提供參考。
1抽樣與制樣
抽樣是轉基因成分檢測的第一個環節，也是非常復雜和重要的環節。抽樣要有代表性，要能準確反映出樣品的總體情況[11]。歐盟國家轉基因安全管理主要遵循預防原則，與我國采取的源頭控制理念類似。以意大利為例，目前意大利尚未批準轉基因作物的商業化種植，在轉基因生物監控計劃實施過程中，邊境檢查站、國家憲兵隊和地區衛生部門等執法機構負責抽樣工作，樣品主要來自進口等環節;農業部執法機構抽檢樣品則主要來源于種子企業的種子庫，基本不對市場上銷售的產品進行檢測。因此，意大利轉基因檢測抽樣主要是針對批次貨物，不涉及田間種植樣品。
在典型情況下，歐盟國家執法機構的抽樣工作參照《Rec.2004/787/ECTechnicalguidanceforsampl-inganddetectionofGMOs》進行[12]，可以對多至109粒的樣品進行抽樣。多個取樣點至少可以獲得105粒種子，將多個取樣點的樣品混勻，從中取出3份各3000粒種子交給轉基因檢測機構進行檢測。轉基因檢測機構將其中一份3000粒種子粉碎，取少量(至少包含105個粉碎的顆粒)粉末提取DNA，用于轉基因檢測(批次樣品量大小及其組成，見表1)。通過了國際種子協會(InternationalSeedTestingAssociation，ISTA)認證的檢測機構，在收樣時遵從ISTA規范的規定，每份檢測樣品至少含有3000粒種子。種子檢測機構一般將樣品分為5份，并研磨其中2份用于轉基因檢測，因此，總收樣量至少15000粒。在我國轉基因檢測工作中，種子類樣品一般至少檢測3000粒。對比來看，我國標準和歐盟的規范均能在95%的置信度下保證0.1%的檢測靈敏度，我國做法是符合國際規范的。
在計算種子數量方面，Tavazzano種子檢測實驗室的做法有自己的特色，在我國標準中，規定了不同作物種子的千粒重，而Tavazzano種子檢測實驗室采用了實測的值。在現實情況中，相同作物不同品種種子千粒重可能有翻番的差別，因此采取一個固定值有較大誤差。在可能情況下，在相關標準制定和修訂時應考慮這個因素。歐盟從事轉基因檢測的第三方檢測機構也采用了經濟合作與發展組織(OrganizationforEconomicCo-operationandDevelopment，OECD)的標準通過了良好實驗室管理規范(GoodLaboratoryPractice，GLP)認證，與政府實驗室類似，其樣品也來源于委托方送樣，并僅對來樣負責。
2轉基因檢測方法的認定
轉基因檢測方法的標準化是獲得準確可靠、具有可比性檢測結果的基礎[13]。JRC下屬歐盟轉基因檢測基準實驗室的主要任務是為歐盟的立法提供技術支持，工作的重點在檢測方法的研究和驗證上，不從事一般的日常檢測工作。依據歐盟法規，申請在歐洲釋放的轉基因生物，需要通過某一成員國主管當局申請。成員國主管當局在確認收到申請的同時，應在90d內作成一份評估報告。若同意申請，成員國主管當局應盡快將評估報告和相關的信息發送給歐盟委員會和其他歐盟成員國。歐盟委員委托歐盟食品安全局(EuropeanFoodSafetyAuthority，EFSA)在醫學、營養學、毒理學、生物學、化學和其他相關學科方面的專家進行評估。如果歐盟食品安全局和其他歐盟成員國沒有提出反對意見，則應以書面形式批準轉基因生物投放市場。與此同時，申請者需向歐盟轉基因檢測基準實驗室(或稱參考實驗室)提交檢測方法和對照材料，由歐盟參考實驗室組織12家歐盟實驗室網絡成員，對檢測方法進行循環驗證。檢測方法達到歐盟相關法規要求的，方可依據安全評價結果，給予授權。歐盟轉基因生物授權程序，見圖1。
由于歐盟要求對轉基因食品進行標識，并設置了標識閾值，因此提交給歐盟參考實驗室的轉基因檢測分析方法均為實時熒光定量PCR檢測方法，依據歐盟對轉基因檢測分析方法最低性能要求的定義，歐盟對檢測方法認定分為兩個階段，第一階段為申請者提交方法文本的檢查，第二階段為檢測方法的循環驗證。在第一階段，主要考察申請者提交檢測方法的如下性能特性：(1)適用性;(2)可操作性;(3)特異性;(4)動態范圍，即檢測的精確性和準確性在線性范圍內的轉基因成分濃度區間;(5)準確性，±25%范圍內;(6)擴增效率，標準曲線斜率在-3.6至-3.1之間;(7)相關系數，R2≥0.98;(8)重復性標準偏差，線性范圍內RSDr<25%;(9)定量極限，RSDr<25%前提下小于法規要求的標識閾值0.9%的1/10，即0.09%或50拷貝;(10)檢測極限，在95%置信度下，小于法規要求的標識閾值的1/20，即0.045%;(11)穩健性，即可以忍受檢測實驗條件的小的變化，在此變化下檢測結果偏差不會超過±30%。在第二階段，主要通過多實驗室聯合測試，確保申請者所提交方法符合歐盟要求，并且在不同實驗室有同樣性能表現�？疾斓闹饕笜藶閯討B范圍、再現性標準偏差和準確性。實驗室聯合驗證中，在精確度方面，所有濃度樣品的RSDr均應低于35%。當濃度小于0.2%時，RSDr在小于50%的范圍內都是可以接受的。在準確度方面，所有濃度樣品的偏差不得超過±30%。
3樣品檢測
歐盟轉基因檢測機構無論采用何種技術規范，參加何種體系的認證，出具的定性或定量報告，基本都采用熒光定量PCR進行檢測。與常規PCR相比，熒光定量PCR顯著減少了實驗室PCR產物污染的可能性。這是因為PCR產物是轉基因檢測實驗室最主要的污染來源之一，而熒光定量PCR不需要電泳，因此反應結束后不需要開蓋，避免了反應產物泄漏造成的污染。此外，與常規PCR相比，熒光定量PCR具有檢測靈敏度更高、檢測速度更快的優點。在意大利轉基因檢測國家基準實驗室定性判斷也是基于熒光定量PCR的結果進行，這種做法減少了實驗室污染，提高了檢測結果的可靠性。因此，我國應在制定和修訂的轉基因檢測相關標準時考慮增加采用熒光定量PCR檢測的內容。
EURL-GMFF是歐盟主要轉基因檢測方法的研制機構之一，核心檢測室都有獨立的溫度、濕度和氣壓控制系統。實驗室內的氣壓分為+20mbar、+10mbar、0mbar、-10mbar及-20mbar等5個等級，EURL-GMFF采用的不僅是簡單的正負壓控制，還根據實驗要求的潔凈程度和污染程度的不同進行了細分。氣壓的多級控制事實上形成了實驗室內部的連續穩定氣流方向，進一步提高了實驗室潔凈程度，從而保證了歐洲基準實驗室方法研究和評價的準確性，這一點值得我國未來的基準實驗室參考。除了擁有實驗室正負壓控制系統外，歐洲基準實驗室大量使用了100%外排生物安全柜。同時，所有的PCR準備工作都在生物安全柜等專門的隔離的設施設備內進行。
成本增加不多，但極大減少了污染的可能性。意大利轉基因檢測國家基準實驗室雖然面積緊張，但仍然采用了DNA自動提取設備，自動分液機械臂，高通量自動進樣熒光定量PCR儀等高端設備，以減少人員的操作誤差和提高工作效率，這是未來轉基因檢測工作的發展方向之一，值得國內跟蹤。根據意大利轉基因檢測國家基準實驗室介紹，其在DNA提取過程中除了使用傳統的CTAB法，也采取了3種不同的商品化試劑盒。由于利用不同方法從不同原料中提取DNA的效率不同，因此在定量時必須采用與標準相同的DNA提取方法。歐洲基準實驗室公布的方法均是基于CTAB的方法，特別是IRMM提供標準物質在質量百分比換算到拷貝數百分比時需要一個矯正系數，這個系數的獲得與CTAB法的提取效率相關聯[14，15]。如果實驗室貿然使用了非標準方法，而沒有考慮以上這些因素，可能造成較大的定量誤差。非標準方法的使用不僅在政府檢測實驗室中存在，而且在企業轉基因檢測機構也同樣存在，如意大利的一些第三方食品安全檢測實驗室等在樣品量大時為了加快檢測速度，使用了快速熒光定量PCR技術。歐洲基準實驗室公布的轉基因檢測方法都公開發布在網站并不斷更新(http://gmo-crl.jr-c.ec.europa.eu/StatusOfDossiers.aspx)。
如果成員國在檢測過程中需要使用的方法歐洲基準實驗室沒有公布，則該國可以組織驗證，并由該國國家基準實驗室發布。在突發事件的檢測中，立法機構可以臨時發布新的檢測方法，并直接授權檢測機構采用。這一點與我國做法類似，但具有更高的靈活性。理論上轉基因檢測技術可分為通用元件篩查、目標基因檢測、載體特異性檢測和轉化事件特異性檢測4個水平。但絕大多數檢測機構均只進行通用元件篩查和轉化事件特異性檢測，而且以上檢測均是以通用元件篩查為基礎，在通用元件篩查結果呈陽性的基礎上，再根據通用元件的信息進行所有可能的轉化事件的檢測，如果篩查結果均為陰性，則不再進行事件特異性檢測。檢測流程如圖2所示。從以上分析可知，通用元件篩查的結果是歐盟轉基因檢測機構判斷樣品是否含轉基因成分的關鍵。
同時，不同機構篩查的轉基因元件有所不同，轉基因檢測國家基準實驗室篩查的元件最多，共篩查CaMV35S啟動子、NOS終止子、PAT基因、NPTII基因和CP4-EPSPS等5個元件，而Tavazzano種子檢測實驗室僅檢測CaMV35S啟動子，選檢NOS終止子。根據公開信息可知，這種策略有較大的漏檢風險。在歐盟采用的定量標識中，如果采用相對定量PCR技術，僅能標識標準曲線最高和最低濃度范圍內的含量，如采用5%的標準物質，連續稀釋至0.1%，那么僅能給出5%-0.1%范圍內的值。超過標準曲線最高點的測定值僅能標識為>5%，低于標準曲線最低點的測定值僅能標識為<0.1%。在沒有擴增信號的情況下，結果表述為
4結果的表述和不確定度
任何定量的結果，均應提供測定值及測定值的不確定度，轉基因含量的定量也不例外[16]。不確定度的計算大體可以分為Bottomup和Topdown兩種方式，分別適用于不確定度來源清晰、可分別測量的工作和來源復雜不可分拆的情況。在歐盟轉基因檢測工作中，轉基因檢測標準物質的研制事實上采用的是Bottomup方式，分別測定各測量、加工步驟產生的不確定度，并最終合成到總的不確定度中。而轉基因檢測方法的不確定度的來源則非常復雜，包括了標準物質的不確定度、不同儀器設備產生的不確定度、不同試劑產生的不確定度，不同操作人員引起的不確定度等(圖3)。這些不確定度有些來源于系統誤差，有些則是隨機因素引起。在系統誤差難以測量的情況下，可以將所有的不確定度當作隨機誤差引起的B類不確定度進行計算。JRC在《GuidancedocumentonmeasurementuncertaintyforGMOtestinglaboratories》中推薦了兩種轉基因檢測不確定度測定方法[17]，分別適合單個實驗室內部確定和利用檢測方法循環驗證數據測定。
在采用沒有多家實驗室循環驗證數據的方法的情況下，可以由單一實驗室的歷史數據來確定該實驗室采用該方法的不確定度。但由于歐盟基準實驗室公布的方法均經過多家實驗室的循環驗證，代表了該方法在一般實驗室使用的情況，并公布了包括檢測方法在各實驗室使用結果的驗證報告，因此可以直接計算出該方法在一般轉基因檢測實驗室使用的不確定度。多數轉基因檢測實驗室選擇了利用循環驗證報告直接計算本實驗室數據的不確定度。事實上，參照《GuidancedocumentonmeasurementuncertaintyforGMOtestinglaboratories》還可以利用檢測方法的驗證報告計算該檢測方法的LOD和LOQ。
因此，這個指南解決了轉基因定量檢測的主要數據處理問題。置信區間事實上是根據t分布計算的。根據《GuidancedocumentonmeasurementuncertaintyforGMOtestinglaboratories》可知，在擴展系數取2時，利用這種方法測定的不確定度事實上是測定值的雙尾95%置信區間。這個計算方法本身并沒有問題。但當該區間的下限超過0.9%時，實際上是有97.5%的概率大于0.9%的歐盟標識閾值，這種做法實際上比法律要求的更高，歐盟的轉基因檢測實驗室工作人員實際上也承認這個缺陷，但由于這個方法來源于歐盟推薦的文獻，因此他們必須采用。我國將來如采用定量檢測和標識，應重新考慮這個問題。
5對我國轉基因生物安全檢測的啟示和建議
5.1建立我國轉基因檢測方法的實驗室循環驗證制度
科學、有效的轉基因檢測方法是轉基因生物安全監管的重要前提和基礎。歐盟在轉基因產品授權程序中，突出強調檢測方法的審查與循環驗證，制定了專門的文件對檢測方法性能要求、認定及驗證程序進行規定，并將檢測方法是否符合歐盟監管要求作為是否給予授權的必要條件。我國對轉基因生物實施全程監管并要求對列入標識目錄的進行標識，檢測方法是我國安全監管和標識制度實施的基礎。目前，我國對于申請安全評價的轉基因生物沒有明確法規要求研發機構提供陽性樣品，對其提供的檢測方法，僅進行文字材料審查。這些無法保證提供的方法滿足我國轉基因檢測機構的使用和安全監管需求。建議將提供陽性樣品和檢測方法作為申報安全證書的必要條件，并開展提供的檢測方法的實驗室循環驗證。
5.2提高我國農業轉基因檢測能力建設水平
通過幾年來的建設，我國轉基因檢測體系基本完善，技術水平也有了很大提高，但與歐盟檢測實驗室及化學類檢測實驗室相比較，整體自動化水平還比較低，檢測通量還很小，檢測成本偏高。因此有必要參考歐盟檢測實驗室的發展經驗，進一步提高我國轉基因檢測能力水平，同時加快推薦配套的標準體系和管理體系的建設。我國目前尚未設置轉基因產品標識閾值，現今生物技術產業迅速發展，零閾值的定性標識導致實際操作困難。
因此，有必要參考歐盟經驗及考慮我國的具體情況調整標識制度。同時對各檢測機構的檢測能力和水平進行進一步提升，大力加強轉基因定量檢測支撐體系建設。在檢測技術方面，我國主要采用定性PCR檢測方法，此方法具有對設備技術要求簡單，檢測成本低等優點，在我國轉基因生物安全監管中發揮了重要作用，但隨著檢測技術水平和監管要求的提高，其不足之處也有所體現。一是與普遍采用定量檢測方法的歐盟等國家或地區檢測結果無法比較、互認，不利于貿易爭端的解決;二是進行凝膠電泳增加了檢測步驟，易產生氣溶膠污染;三是在檢測的靈敏度、準確性方面與定量PCR有差距。另外，我國大部分檢測機構都配備了定量PCR儀，掌握了實時熒光PCR檢測操作技術。因此，建議推進定量PCR在我國檢測機構中的應用并逐步替代定性PCR，推進轉基因檢測與國際接軌。
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