本文摘要：摘要：利用抗壞血酸協同過氧化氫法降解褐藻多糖，以DPPH自由基清除率為指標，通過工藝優化得到最佳降解條件，然后用超濾技術將降解產物進行分級，獲得不同分子量組分，并分析其DPPH自由基清除率、保濕效果，酪氨酸酶抑制率等活性。正交試驗結果表明，最佳降
摘要：利用抗壞血酸協同過氧化氫法降解褐藻多糖，以DPPH自由基清除率為指標，通過工藝優化得到最佳降解條件，然后用超濾技術將降解產物進行分級，獲得不同分子量組分，并分析其DPPH自由基清除率、保濕效果，酪氨酸酶抑制率等活性。正交試驗結果表明，最佳降解條件為VC濃度20mmol/L、降解溫度45℃、降解時間3h，在此條件下獲得的降解產物的DPPH自由基清除率達到61.23%，降解產物得率為73.16%。電泳結果表明，降解后的褐藻多糖的條帶明顯出現在低分子量區。利用超濾系統將降解產物分級為5kDa、10kDa、1030kDa、>30kD四個不同分子量段的組分，研究發現各分子量段之間的活性存在顯著差異(<0.05)，尤其5kDa組分(其主要成分為2.140×10Da，占比29.6%)的活性最好，其DPPH自由基清除率為59.27%，60后保濕率為75.75%，酪氨酸酶抑制率為65.28%。與褐藻多糖相比，其糖醛酸含量稍有下降。本研究結果可為褐藻多糖在功能性食品等領域的應用提供理論依據。
關鍵詞：低分子量褐藻多糖，制備，DPPH自由基清除率，保濕效果，酪氨酸酶抑制率
褐藻多糖，又名褐藻多糖硫酸酯、褐藻膠，主要來源于海帶、巨藻、泡葉藻、墨角藻等海藻，集中于褐藻植物細胞壁中，是一種含有硫酸基團的高分子量的雜多糖，具有抗氧化、降尿酸、抗腫瘤、抗病毒、抗炎等生理功能[13]，在功能性食品、果蔬保鮮等方面具有較大應用潛力。然而，由于天然褐藻多糖存在著分子量大、黏度高，滲透性差，不利于吸收等問題，其應用受到很大限制。
研究表明，通過一定方式降解多糖，獲得低分子量多糖，能夠提高多糖的生物活性和生物利用率[4,5]。Zhao等[6]以海帶為原料制備的低分子量巖藻多糖對超氧自由基、羥自由基等有較強的體外清除作用。Xue等[7]研究表明低分子量的硫酸多糖對低密度脂蛋白的氧化作用強于粗巖藻糖。任立士等研究發現通過利用自由基降解法制備的海藻寡糖，具有良好的清除自由基的能力[8]。因此，通過適當方法降低褐藻多糖分子量，是發揮其生理活性的重要途徑。
目前，低分子量褐藻多糖的制備方法可分為物理法、化學法、生物酶解法[7]。生物酶解法條件溫和且分子量較易控制，但酶制劑價格昂貴且不易獲得[9]。硫酸基團對褐藻多糖活性的發揮起到很重要的作用，ang、Mohsin等研究發現，低分子量褐藻多糖自由基清除能力、抗凝血活性與硫酸根含量成正相關1011。Anastyuk等2]研究發現，由于硫酸酯基及α，巖藻糖苷鍵的存在，低分子量褐藻糖對人體惡性黑色素瘤細胞系SKMEL28表現出了較好的抑制性。Shao等13研究表明，體外抗癌活性與褐藻多糖分子中的硫酸根含量有關。
同時，硫酸化的褐藻多糖被報道具有抑制單純形皰疹病毒(HSV)和人類免疫缺陷病毒(HIV)的能力1415，甚至被推斷具有抗新冠病毒(coronavirusdisease2019COVID19)的能力16。因此在選擇方法的時候應著重注重對硫酸基團的保護，但化學方法對硫酸基團的破壞較為嚴重，不適合應用。作者前期實驗表明，利用自由基法可有效降解褐藻多糖，同時不會過度破壞硫酸基團。因此，本實驗利用抗壞血酸輔助過氧化氫法對褐藻多糖進行降解，以DPPH自由基清除率為指標進行降解條件優化。利用超濾系統對降解的多糖進行分級，對比不同分子量段降解多糖的DPPH自由基清除率、保濕性以及酪氨酸酶抑制活性，分析其分子量及化學組成，以期為褐藻多糖在食品等領域的應用提供依據。
1材料與方法
1.1材料與儀器褐藻多糖：山東潔晶集團股份有限公司;瓊脂糖凝膠：青島源葉生物技術公司;透明質酸：廣州高良生物科技有限公司;DPPH：北京索萊寶科技有限公司;過氧化氫、抗壞血酸等均為市售國產分析純。真空冷凍干燥機：德國CHREIST公司;DU800型紫外可見分光光度計：美國貝克曼公司;SHAB水浴恒溫振蕩器：常州國華電器有限公司;高速臺式冷凍離心機：湖南湘儀離心機儀器有限公司;DYY6C型電泳儀：北京市六一儀器廠;超濾膜分離系統：美國賽默飛公司;十八角度激光光譜散射儀：美國Wyatt公司;DGU20A5R高效液相色譜儀：日本島津公司。
1.2實驗方法
1.2.1褐藻多糖的降解
配制1%的褐藻多糖溶液，加入一定體積的30%過氧化氫和抗壞血酸，在一定溫度下降解一段時間后，用0.01mol/L氫氧化鈉(NaOH)調節溶液pH至中性，采用200D透析袋，蒸餾水透析，凍干后得降解產物。
1.2.2褐藻多糖降解單因素及正交試驗
以褐藻多糖降解產物的DPPH自由基清除率為指標，使用過氧化氫結合抗壞血酸的方法降解褐藻多糖[17,。配制1%的褐藻多糖溶液，以實驗條件VC濃度15mmol/L(向100mL褐藻多糖溶液中添加153µL30%過氧化氫溶液和0.26gVC)、降解溫度℃、降解時間為固定因素水平，按照表替換相應因素水平進行單因素實驗。根據單因素試驗結果，設計因素水平正交試驗，以褐藻多糖降解產物DPPH自由基清除率為指標確定最佳降解條件。
2結果與分析
2.1單因素試驗結果分析
隨2–VC用量增加，清除率從40.2%升至56.1%，2–VC用量為20mmol/L之后清除率開始下降。這可能是由于含量過高時，自由基氧化反應劇烈，產物脫硫現象和脫羧反應較為嚴重2425，因此，2–VC的最適用量為20mmol/L。一般來說，溫度的升高會導致反應速率的增加，更高的溫度意味著更高的分子平均動能和單位時間內更多的碰撞26。
隨著溫度的升高，清除率快速升高，當溫度到45℃時，清除率達到最大為54.1%，因此，適當提高反應溫度有利于活性增強。當溫度高于45℃時，清除率開始下降，原因可能是當溫度過高時，VC活性降低并且部分分解，導致降解多糖的能力降低，導致清除率下降27，因此最適溫度為45℃。如圖所示，隨著反應時間的延長，DPPH自由基清除率呈現先上升后平緩趨勢，當降解時間為3h時，清除率達到最大值為48.9%。原因可能隨著時間的延長，多糖分子量不再減小或者分子量減小趨勢變緩,29]，使DPPH自由基清除率趨于平緩，因此，最適降解時間為3h。
2.2正交試驗結果分析
在單因素試驗的基礎上，選取2VC濃度、降解溫度和降解時間三個因素，每個因素各取三個水平，各因素對抗氧化活性的影響程度依次為2VC濃度>降解時間>降解溫度，2–VC的用量對褐藻多糖降解后DPPH清除率影響最為大，最佳組合是，即2VC濃度為20mmol/L、降解溫度45℃、降解時間。隨后進行了最佳組合驗證實驗，所得降解產物的DPPH自由基清除率為61.23±0.55%，高于正交試驗中的最高值，證明正交實驗結果有效，此條件下降解產物得率為73.16%。
3結論
本研究以DPPH自由基清除率為評價指標，建立了以2VC自由基法降解褐藻多糖的方法，正交試驗優化得到最佳降解條件為2VC濃度為20mmol/L、降解溫度45℃以及降解時間3h，最佳條件下降解產物得率為73.16%，DPPH自由基清除率為61.23%。凝膠電泳結果表明，降解后的褐藻多糖的條帶明顯出現在低分子量區，說明該降解法穩定并有效。
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通過超濾系統將此產物降解分為5kDa、5kDa10kDa、10kDa30kDa、30kDa四段，DPPH自由基清除率、保濕性、以及酪氨酸酶抑制活性研究表明，<5kDa分子量段的組分的活性顯著高于其它組分(<0.5)。進一步測定了<5kDa分子量段組分的單糖組成與分子量分布，結果表明，與多糖相比，該組分的巖藻糖含量略高，葡萄糖醛酸含量相對減少;經測定，該組分主要含有五個組分，其中2.140×10Da含量最高，達到29.6%，其次是4.126×10Da組分，占比為24.1%。研究結果可為低分子量褐藻多糖的在功能性食品等領域的應用提供數據基礎，下一步可以在低分子量褐藻多糖的構效關系方面開展更深入的研究。
參考文獻
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作者：闕斐，陶文靖,馮文婕
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