本文摘要：摘要：本研究旨在篩選出能產生促進植物生長的揮發性有機化合物(volatileorganiccompounds，VOCs)的潛在植物根際促生菌(plantgrowthpromotingrhizobacteria，PGPR)，考察其VOCs對植物的促生作用及其它促生功能，為研發微生物肥料提供新的思路及可靠的材料。以
摘要：本研究旨在篩選出能產生促進植物生長的揮發性有機化合物(volatileorganiccompounds，VOCs)的潛在植物根際促生菌(plantgrowthpromotingrhizobacteria，PGPR)，考察其VOCs對植物的促生作用及其它促生功能，為研發微生物肥料提供新的思路及可靠的材料。以本實驗室從海洋樣品中分離保存的48株功能菌為供試菌株，通過二分隔平板實驗、VOCs盆栽實驗進行篩選，結合菌株的16SrRNA進行鑒定，通過氣相色譜-質譜聯用的方法(GasChromatography-Mass，GC-MS)對菌株所產VOCs成分進行分析。通過平板活性實驗對細菌的固氮，溶磷及產IAA進行活性檢測。研究結果顯示：篩選得到1株潛在PGPR-GX14001，其所產生的VOCs對本氏煙草(Nicotianabenthamiana)和上海青(BrassicachinensisL.)均表現出明顯的促生作用，菌株經16SrRNA鑒定為橙色微桿菌(Microbacteriumaurantiacum)。經GC-MS對其VOCs成分分析，共得到7種特異性化合物。經平板活性檢測，GX14001具有較強的溶有機/無機磷活性和一般固氮活性，而其產IAA能力較弱，為1.737μg/mL。PGPR可通過不同的促生機制對植物表現出促生作用，研究結果表明GX14001所產VOCs對植物有明顯促生作用，其他方面的促生活性并不高，兩者之間不存在較高的正相關性，說明其最主要的促生作用是通過所產生的VOCs獲得的。
關鍵詞：植物促生菌;揮發性有機物;橙色微桿菌;溶磷
化肥和農藥在我國農業歷史上發揮了巨大的增產作用，但長期使用化肥會造成土壤板結，肥力下降，農產品品質降低，污染環境等一系列問題[1]。隨著現代生物科學技術的進步，應用微生物代替化肥和農藥在農業方面有廣泛的應用前景。微生物肥料因其生產成本低、效果好、不污染環境以及有助于農業可持續發展等特點受到廣泛關注。由于微生物肥料的快速穩定發展，對PGPR的研究與開發也成為研究熱點[2]。
PGPR是一類能夠在植物根際定殖，通過固氮、溶磷、抗病、增加植物對營養元素的吸收、調整植物激素濃度以及產生揮發性有機物等多種機制促進植物生長的有益微生物的總稱。微生物產生揮發性有機物是促進植物生長的一個重要促生機制，已有研究報道，枯草芽孢桿菌[3-7]，解淀粉芽孢桿菌[3，7]、產堿假單胞菌[8]、放線菌[9]、木霉真菌[10]、枝孢樣枝孢霉[11]等多種微生物產生的VOCs能夠通過調節植物激素[12]，誘導系統耐受性[13]及系統抗性[14]等多方面促進植物的生長。
本實驗從實驗室已保存的48株菌株中通過二分格平板實驗篩選得到一株所產VOCs對植物有明顯促生作用的潛在PGPR菌株GX14001，經16SrRNA鑒定后進行了VOCs盆栽實驗，以進一步驗證其所產VOCs對植物的促生作用。通過GC-MS對GX14001所釋放的VOCs進行了成分檢測，之后對其固氮、溶磷、產IAA活性進行了研究。本研究為微生物菌肥資源的開發與利用提供新的選擇。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1供試菌株
供試菌株為從海洋分離得到的48株可培養的功能菌株，保藏于廣西多糖材料與改性重點實驗室。
1.1.2植物材料本氏煙草(Nicotianabenthamiana)，上海青(BrassicachinensisL.)。
1.1.3培養基TSA培養基，TSB培養基及MS培養基均購自青島海博生物技術有限公司，蒙金娜有機培養基[15]，PKO無機培養基[16]，Ashby無氮培養基[17]，埃利希氏反應顯色試劑。
1.1.4主要試劑和儀器細菌基因組DNA提取試劑盒及所用引物合成：天根生化科技有限公司;PCR擴增反應相關試劑及限制酶等：北京康潤誠業生物科技有限公司;PCR擴增儀：BioRadT100;智能人工氣候箱：浙江托普RTOP-1000B;搖床：上海旻泉MQD-B1R;固相微萃取探針，購自青島貞正分析儀器有限公司;氣相色譜-質譜聯用儀：安捷倫5975C-7890A。
1.2方法
1.2.1細菌發酵液的制備將供試細菌接入TSB液體培養基中培養，培養條件：30℃，200r/min，24h。之后將菌液用無菌水稀釋至1×108CFU/mL備用。
1.2.2細菌與煙草共培養
1.2.2.1煙草預處理用75%(V/V)醫用酒精對煙草種子上下輕緩顛倒消毒2-3min后，再用1%的次氯酸鈉溶液(V/V)消毒2-3min，之后用無菌水將煙草種子沖洗4-5遍，清洗種子表面的消毒劑，防止殘留消毒劑影響種子萌發。將消毒后的煙草種子點種在MS培養基上，用封口膜將平板封好后，放在25℃智能人工氣候箱培育至發芽出苗。智能人工氣候箱的條件為白天16h，黑夜8h，溫度25℃。
1.2.2.2共培養實驗本實驗采用9cm二分格培養皿進行實驗，一側培養煙草，另一側培養細菌，由于物理界限，細菌的分泌及代謝物不能和煙草進行接觸和交流，但細菌釋放的揮發性有機物可通過培養皿上空與煙草進行交流和作用。將培養5d生長狀況一致的煙草苗移栽到二分格培養皿的MS培養基中，每個培養皿移栽5棵，保持每棵煙草間距一致，在另一側TSA培養基接種10μL菌液，菌含量約為1×108CFU/mL，每個菌株做3個平行，以接種10μL滅菌水作為對照。將平板用封口膜封好后，放入智能人工氣候箱培養，培養條件與之前一致，培養14d之后對煙草的生物量進行測量與統計。
1.2.3菌株鑒定采用細菌基因組DNA提取試劑盒提取供試菌株的總DNA。用細菌通用引物27-F：5'-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3'，1492-R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'進行16SrRNA基因的擴增。PCR反應體系：模板1μL，正反向引物各1μL，2×TaqPCRStarMIXwithLoadingDye25μL，用ddH2O補足至50μL。PCR反應條件：95℃預變性4min;95℃1min，55℃1min，72℃2min為一個循環，進行32個循環;72℃延伸10min;最后4℃10min。將PCR擴增產物送上海生工進行測序，所得序列通過Ezbiocloud進行序列同源性比對分析。
1.2.4盆栽實驗將上海青種子進行消毒處理后，播種于已高壓濕熱滅菌的土壤中。每個盆栽3株幼苗，待長出兩葉一心時，對其作處理。將菌株在TSA培養基上活化，挑取單菌落至裝有TSB液體培養基的瓶子中，30℃，200r/min培養24h后放置盆栽下方，用封口膜將盆栽裝置接口處封好，防止細菌產生的揮發性有機物滲出，確保其能與植物的根部處于同一密閉空間。培養21d后進行各項指標的測量與記錄。
1.2.5頂空固相微萃取氣質聯用法(headspacesolidphasemicroextraction/GC-MS，HS-SPME/GC-MS)分析菌株產生的VOCs成分1.2.5.1細菌樣品預處理將供試細菌GX14001在裝有TSB液體培養基的固相微萃取瓶中進行活化培養，30℃，200r/min培養24h備用。
1.2.5.2萃取探針的預處理本實驗選擇活性炭/聚二甲基硅氧烷/聚二乙烯基苯(ACAR/PDMS/DVB)復合涂層的固相微萃取探針，適合較寬范圍揮發性有機物的萃取。萃取探針使用前進行老化，老化條件為260℃，60min。1.2.5.3GC-MS條件實驗條件：載氣為He;不分流進樣;進樣口溫度為230℃;爐溫起始為40℃，保持3min，以3℃/min升溫至140℃，保持2min;再以20℃/min升溫至230℃，保持2min;離子源為EI源;采用Nist08譜庫進行檢索。
2結果
2.1菌株產生的VOCs對煙草的促生作用
對48株菌株進行VOCs二分隔平板實驗，培養14d后對煙草的生物量進行測量與統計。研究發現，GX13594、GX13747、GX14001、GX14016、GX14066、GX14070、GX14201這7個菌株處理組的鮮重，根長，側根數，葉片長及葉片寬均顯著高于CK對照組(P<0.01)，結果表明這7個菌株所產生的揮發性有機物對煙草都具有明顯的促生作用。
3討論
微生物大致可通過直接和間接兩個促生機制來促進植物的生長[18]。其中直接促生機制主要是通過調整植物激素濃度，增加植物對養分的吸收以及釋放揮發性有機化合物(VOCs)來促進植物的生長;間接促生機制是通過誘導植物產生系統抗性和抑制病原菌的入侵來促進植物生長[19]。與其他促生機制不同，微生物釋放的VOCs可以在不與植物進行物理接觸的情況下，通過提高植物生物量、抗病(蟲)性和非生物脅迫耐性來發揮對植物的促生作用，這是其優勢所在[20]。
本文主要研究了從海洋分離得到的橙色微桿菌GX14001的VOCs對植物生長的促生作用，對其產生的VOCs成分及菌株的其他促生特性進行了分析檢測。迄今為止，關于PGPR所釋放的VOCs對植物促生作用的研究大多以假單胞菌屬和芽孢桿菌屬為主，微桿菌屬的報道較少。
Cordovez等[21]研究表明微桿菌菌株EC8-VOCs通過調節植物根部硫和氮的代謝從而促進植物生長，并且發現其誘導植物生長促進具有組織特異性的。本文研究發現橙色微桿菌GX14001-VOCs能夠誘導植物葉片和鮮重增加，在模式植物本氏煙草和經濟作物上海青中均有體現。對微生物產生的VOCs的收集和成分分析一般采用頂空固相微萃法[22]和氣相色譜-質譜法。目前已報道的PGPR釋放的能促進擬南芥生長的VOCs主要有以下幾種：2，3-丁二醇以及合成2，3-丁二 醇的前體乙偶姻(3-羥基-2-丁酮)[3]，低濃度的1-己醇以及高濃度的正十五烷[23]，1-癸烯[10]等。
Velázquez-Becerra等[24]研究表明運動節桿菌UMCV2產生的二甲基正十六胺能促進紫花苜蓿的生長發育。Yamagiwa等[25]發現促進植物生長的真菌Talaromycessp.產生的β-石竹烯能夠有效促進甘藍型油菜幼苗的生長。Paul等[11]研究發現根際促生真菌CladosporiumcladosporioidesCL-1產生的VOCs， α-蒎烯、(-)反式-石竹烯、2，2，5，5-四甲基四氫呋喃、脫氫香橙烯以及(+)-苜蓿烯對煙草幼苗具有促進能力。本實驗篩選得到的GX14001所產生的VOCs經GC-MS分析表明，與對照相比有7種特異性化合物，可分為苯基類和烷類化合物。其中烷類化合物有4-甲基-癸烷、十二烷、二十五烷和9-辛基-十七烷四類。
烷類化合物是目前已報道的具有活性的揮發性物質，該GC-MS分析得到的十二烷和二十五烷曾在2017年被Jishma等報道是能促進植物生長的VOCs成分[26]。苯基類化合物有鄰乙基甲苯，1，2，3-三甲苯和1，2，4-三甲苯。苯基類化合物大都能在細菌/真菌的揮發性物質中被檢測到，乙苯曾在生物測定實驗中被發現具有殺蟲作用[27]，最終結果表明十二烷，1，2，3-三甲苯，鄰乙基甲苯及二十五烷的含量相對較高，結合前人研究推測GX14001釋放的VOCs起主要促生作用的成分可能為十二烷及二十五烷，關于其他成分的具體作用還需進一步分析研究。
微生物評職知識： 微生物處理污水論文發表期刊
4結論
本實驗通過二分隔平板實驗及VOCs盆栽實驗發現GX14001釋放的VOCs對煙草和上海青的根部及葉片的生長都有顯著的促進作用，該菌株經16SrRNA分子生物學鑒定為橙色微桿菌。GC-MS結果顯示GX14001釋放的VOCs成分中起主要促生作用的成分為烷類。平板活性檢測結果顯示，GX14001菌株具有一定的溶磷和固氮作用，而產IAA能力較低。研究結果表明，該菌株促進植物生長主要是通過產生揮發性有機化合物(VOCs)來實現的，通過對菌株其他活性的檢測表明橙色微桿菌是促進植物生長的多功能有效菌株。本項工作為微生物肥料的研制與開發提供參考依據。
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作者：高亞慧 姜明國 豐景 周桂
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