人體樣本中脂肪酸分析方法研究進展

　　【摘要】綜述了人體樣本中脂肪酸分析常用的預處理方法、衍生化技術和儀器分析技術的發展情況;重點總結了衍生化技術在脂肪酸分析中的應用現狀和進展;闡述了最新儀器檢測方法，如“鳥槍”式直接進樣法和“中心”二維質譜法在該領域的最新發現;回顧了重要脂肪酸參考值范圍。綜述認為開發選擇性好、效率高、穩定性強的衍生化技術，使用脂肪酸內源性血漿/血清的質量控制品以及與被測組分性質相似的內部標準品，是獲得脂肪酸分析準確、可靠結果的有效途徑。

　　關鍵詞：脂肪酸;生物樣本;分析方法;研究進展

　　脂肪酸是人體能量儲存、細胞結構和細胞信號轉導等多種生化途徑的重要代謝物。近期研究發現，某些脂肪酸組成變化與機體內代謝水平異常以及疾病呈顯著相關，如肥胖、胰島素代謝紊亂、阿茲海默癥、癌癥等代謝異常或生理異常都會影響體內脂肪酸組成[1]。

　　脂肪酸論文范例： 反芻動物肌內脂肪及脂肪酸調控研究進展

　　已有文獻報道，脂肪酸組成可以作為臨床綜合診斷指標，如血清中C16:1n7/C16:0是鑒別脂肪肝與脂肪性肝炎的指標[2];兒童注意缺陷與多動障礙患者血漿中多不飽和脂肪酸濃度低于正常值[3]。由此可見，定量分析脂肪酸組成對營養評估及臨床診斷有重要價值。人體樣本中脂肪酸含量低、分類繁多且生物樣品基質復雜，分析方法常常難以獲得令人滿意的定性能力和檢測靈敏度，極大制約了脂肪酸研究的進一步深入。

　　目前，分析生物樣本中脂肪酸的檢測方法主要有氣相色譜類方法、液相色譜類方法以及酶聯免疫法，其中氣相色譜類方法是最成熟也最經典的方法，非常適合脂肪酸組分分析。而液相色譜類方法近幾年來的創新點主要集中在設計、合成新型脂肪酸衍生化試劑，達到降低基質效應、提高靈敏度的目的。酶聯免疫法雖然能在短時間內檢測生物樣品中的DHA，但一次只能獲得單種游離脂肪酸的檢測值。

　　本文綜述了近年來人體樣本中脂肪酸的分析方法及研究進展，重點討論了不同樣品中脂肪酸的提取方法、基于衍生化的色譜和質譜分析方法以及文獻報道中的參考值范圍;擬通過對這些研究成果的綜述，為建立我國人體樣本中脂肪酸檢測標準化方法和人群標準參考值提供借鑒。

　　1脂肪酸檢測的預處理方法

　　研究者通常根據研究目的不同，提取不同研究對象中的游離脂肪酸或/和酯化脂肪酸或是全脂質。游離脂肪酸可在酸化條件下用烷類溶劑提取。Quehenberger等[4]用鹽酸甲醇酸化樣品后，用異辛烷提取了細胞、血漿、肝臟勻漿液、脂肪勻漿液中的游離脂肪酸。但此法不適合含磷酯較多的樣本，因為磷酯在酸化條件下易分解產生游離脂肪酸，對檢測造成干擾。

　　在分析血漿、血清、母乳等液體中的游離脂肪酸和酯化脂肪酸時，經常采用先酸解再皂化的方法。美國CDC[5]取100μL人血清或血漿，加鹽酸乙腈溶液酸解，氫氧化鈉甲醇皂化，分析了人群血清中30種脂肪酸。Santos等[6]優化了此法，將酸解和皂化的時間延長，建立了健康人血漿中31種脂肪酸含量參考范圍。長鏈多不飽和脂肪酸極性小、疏水性強，正己烷提取效果欠佳。

　　Serafim等[7]采用冰浴后的正己烷：異丙醇(3:2,v/v)，提高了溶劑萃取效率，獲得了血漿中5種長鏈/超長鏈不飽和脂肪酸。 在分析總脂質成分時，常采用經典的Folch[8]或Bligh-Dyer[9]脂質萃取法。簡要來說，Bligh-Dye法中氯仿/甲醇/水的體積比為1:2:0.8，適用于組織、細胞內少量脂質提取;Folch法氯仿用量大，氯仿/甲醇/水的體積比為8:4:3，更適合含大量脂質的樣品。在一些優化方法中，常用毒性更小的二氯甲烷來代替氯仿，具有相似效果。腸道內容物或糞便中含有較多的短鏈脂肪酸，具有分子量小、揮發性高、水溶性較大的特點，一般用沸點低、易去除的乙醚或乙醇提取[10]。提取時加入鹽酸、硫酸、偏磷酸等，可阻止短鏈脂肪酸水解，有效沉淀蛋白等雜質，提高回收率。

　　2分析方法

　　脂肪酸這類物質較難氣化，沒有良好的電離基團和顯色基團，在氣相色譜類或液相色譜類儀器中靈敏度較低。但脂肪酸在衍生化后，能獲得良好的色譜分離和質譜定性效果，實現復雜組分的準確定量、定性。此外，使用同位素內標也能在一定程度上減小基質效應和操作誤差。

　　2.1氣相色譜法及氣相色譜-質譜聯用法

　　氣相色譜類分析技術與衍生化方法聯用是目前應用最廣泛的脂肪酸檢測方法，具有定性定量準確、針對性強的特點。

　　其中，甲酯化方法是由脂肪酸與甲醇在各種催化劑條件下生成脂肪酸甲酯，其常用的方法有三氟化硼/甲醇法[11]、硫酸/甲醇法[6]、乙酰氯/甲醇法[12]等;脂肪酸甲酯具有正電性，適合GC-FID[11]、GC-MS-EI[13,14]、GC-TOF-MS[12]等儀器分析。Abdelmagid等[11]采用氣相色譜法檢測了人血漿中13種長鏈脂肪酸，建立了正常人群脂肪酸含量參考范圍，用以判斷缺乏、過剩及與慢性疾病的關聯。

　　方法用14%三氟化硼/甲醇法衍生化，外標法定量，中強極性色譜柱檢測。但是由于血液樣品量少，無法進行回流條件，三氟化硼不能快速甲酯化，反應溫度高時間長，甲酯化效率較低。 為了進一步降低檢測限，Santos等[6]采用大體積進樣氣相色譜-真空紫外光譜法(LVI-GC-VUV)檢測了人血漿中31種脂肪酸，作為診斷代謝疾病的指標。方法進樣量400μl，用2%濃硫酸甲醇溶液甲酯化。研究者常根據待測物性質和實驗條件選擇不同濃度的濃硫酸/甲醇溶液，濃硫酸用量一般在2%-10%之間。

　　在脂肪酸檢測時，經常發生幾種不同物質具有相同保留時間或保留時間很接近的現象，如亞油酸和α-亞麻酸，使用質譜有效避免了混淆。對于GC-MS，使用EI源得到大量碎片信息后，可以通過標準譜庫進行結構鑒定。Ukolov等[15]采用GC-MS-EI、非極性色譜柱分析血漿、尿液中39種游離脂肪酸，采用氫氧化四丁基銨催化劑、碘甲烷衍生化試劑對脂肪酸進行甲酯化，二氯甲烷提取。

　　這種甲酯化方法可在室溫下快速反應、無需禁水。方法考察了樣品的保存溫度和保存時間，發現樣品在-20℃或-70℃下保存沒有區別，但保存時間超過2個月時多數脂肪酸測定值明顯降低。ChanSeo等[13]采用三氟乙酰胺(MTBSTFA)與脂肪酸生成烷基化衍生物，在選擇離子模式下用GC-MS-EI分析人血漿中44種脂肪酸。脂肪酸烷基化衍生物在EI離子源中規律性地丟失叔丁基或甲基，形成響應較強的特征離子對[M-57]+、[M-15]+以及脂肪酸帶電離子[M+]，易于辨別。但MTBSTFA衍生物遇酸和水立即分解，衍生物保存時要十分小心。

　　另一種GC-MS電離源，NCI負化學電離源的“軟電離”效應保持了脂肪酸結構的完整性，有利于脂肪酸衍生物的定性分析。衍生化試劑五氟芐基溴的衍生物具有很高的負電性，性質與NCI源高度匹配，大幅提高了靈敏度。美國CDC[5]采用GC-MS-NCI法調查了人群血漿中30種脂肪酸情況，以五氟芐基溴為衍生化試劑，三乙胺催化反應進行，同位素內標定量，高極性色譜柱分析。此方法用NIST標定值的冷凍人血清中脂肪酸等質量控制物質核查分析過程以及儀器準確性，最大程度提高了血清/血漿中脂肪酸組分檢測的可信度。

　　氣相色譜-飛行時間質譜聯用技術(GC-TOFMS)是最有潛力的氣質聯用技術之一，TOF質量分析器具有比四極桿氣質聯用儀更高的分辨率和更寬泛的質量范圍(1-1200amu)，質量精度也高，極大改善了譜圖的信噪比。MichaelGoettel等[12]采用乙酰氯甲醇衍生化法，GC-TOF-MS定量分析了人血漿中44種脂肪酸，反映了戒煙前后人血漿中的脂肪酸譜的變化，精確定量了C4:0到C32:0的脂肪酸同分異構體及其代謝物。

　　2.2液相色譜-質譜聯用方法

　　脂肪酸與不同衍生化試劑結合，可接上紫外基團或熒光基團提高檢測信號;也可實現脂肪酸在LC質譜不同離子源的正、負離子模式下電離，提高檢測效能。硝基苯肼類是常用紫外衍生化試劑。Chen等[16]使用2-硝基苯肼衍生化方法分析了人血清中18種脂肪酸(C4:0-C26:0)，Phenyl-Hexyl(苯基-己基)色譜柱，方法中過量硝基苯肼類試劑和反應副產物對LC-MS/MS分析的干擾性較小。高永平[17]自制熒光衍生化試劑1-[1-(哌嗪)乙酮]-2-[(4-二甲氨基)苯基]-菲[9,10-d]咪唑(DPPIPE)，柱前衍生化，高效液相色譜-熒光檢測器法分析了人體血漿中8種脂肪酸。熒光衍生試劑可以與目標化合物耦合上能產生熒光的生色基團，與熒光檢測器聯用，提高選擇性和10倍以上的靈敏度。

　　文中作者認為分析長鏈脂肪酸時，C8色譜柱比C18色譜柱更能避免疏水性內源干擾物質。在液相質譜中，通過酰胺衍生化可產生脂肪酸陽離子衍生物，配合正離子模式(ESI+)、流動相中加入甲酸促電離，有效改善了色譜分離度、提高了靈敏度。Bian等[18]通過膽胺衍生化法，改進了長鏈脂肪酸在人血清中的電離和分離效率，與長鏈脂肪酸非衍生化方法相比，平均LOD提高了大約60倍。反應時脂肪酸先與鎓鹽類縮合劑反應生成中間體，中間體再與膽胺發生反應，加入的三乙胺提供了弱堿性環境促進反應進行。Jiang等[19]提出了一種孿生化衍生化方法。

　　方法用磺酰哌嗪衍生血清樣品中的脂肪酸，用二甲基磺酰哌嗪衍生標準品作為定量參照品，進樣前1:1混合，儀器中每個脂肪酸都有相應的參照品。由于兩種衍生化產物在結構和物理化學性質上都極其相似，血清中脂肪酸與參照品之間的定量差異比使用同位素內標更小，同時有利于在LC-MS/MS中提供一對一的內部標準。短鏈脂肪酸的理化性質與中長鏈脂肪酸有較大區別，衍生化能改變其出峰靠前、電離度差的特點。Jaochico等[20]采用含有吡啶的衍生化試劑O-芐基羥胺和碳二亞胺鹽酸(EDC·HCL)，建立了反相HPLC-MS/MS方法來定量人血漿和尿液基質中的9種短鏈脂肪酸方法。

　　吡啶易電離提供了平衡態的弱堿性環境，能促進反應進行。O-芐基羥胺衍生化操作簡單、反應速度快、不用加熱，不過這種非目標性衍生化反應產生的中間副產物過多，過量衍生化試劑常會干擾檢測靈敏度和重現性。Song等[21]采用乙酰肼類化合物吉拉德-T試劑(Girard’sreagentT,GT)和EDC衍生化了直腸真桿菌體外培養基上清液中的5種短鏈脂肪酸(C2:0-C6:0)。丙酸經GT試劑衍生化后，靈敏度是未衍生化的1.2×108倍，是3-硝基苯肼衍生化時的100倍，靈敏度顯著提高。

　　2.3其他分析方法

　　近年來，為了發現新的脂肪酸異構體、研究脂肪酸及其代謝物，研究者們開發出一些新的脂質組學分析法。Zhao等[22]利用“鳥槍”式直接進樣法分析了人血漿中不飽和脂肪酸中“C═C”雙鍵異構體。樣品不經過色譜柱分離，進樣后直接進入質譜，根據電荷差異在離子源內進行分離。實驗發現，人血漿中重要脂肪酸C18:1有兩種“C═C”位置(∆9和∆11)同分異構體存在。

　　但此法不適合難電離的脂質成分。Wang等[23]開發了一種中心切割二維液相色譜-質譜方法，能在30分鐘內識別了血漿中700余種游離脂肪酸及代謝物。化合物由預柱洗脫按極性分為代謝組和脂質組，中心切割系統通過不同閥門將以上2個組分切割到不同的液相色譜柱中進行分離。在一次進樣中可得到代謝組分和脂質組分的數千個代謝產物信息，準確辨別雙鍵異構體和對映異構體。

　　3血漿/血清中游離脂肪酸及酯化脂肪酸參考值范圍

　　脂肪酸是機體重要代謝標志物，健康人體血漿或血清樣本中脂肪酸組成相對穩定。文獻[3,16,24,25]中，正常組中棕櫚酸、油酸、α-亞油酸的范圍在285.4-4064.5µmol/l、178.7～3900µmol/l、279.7～4970.5之間，最低值與最高值之間最大差異在21倍以內。而人們頗為關注的Omega-3家族脂肪酸α-亞麻酸、EPA、DHA的范圍在0.8～400.1µmol/l、4.4～829µmol/l、6.4～437.7之間，最低值與最高值的最大差異可達500倍，其參考范圍出現了較大差異。

　　但是由于各實驗室的分析方法不一樣、定量方法既有內標法又有外標法、沒有使用標定的質量控制物質校正結果等原因，結果的可靠性較難評判，研究成果僅適用于實驗室內部使用，很難說明Omega-3脂肪酸參考范圍的差異是正常的還是異常的。此外，一些文獻中使用面積歸一法計算各脂肪酸峰面積的相對值(%)，沒有準確定量值使其數據難以再次分析，無法將數據資源利用充分。而通過標準曲線定量來得到絕對值(臨床上常用摩爾濃度表示)，是一種能準確表示脂肪酸含量，也能方便進一步分析、統計的表示方式，具有先進性，應得到廣泛使用。

　　4展望

　　脂肪酸組分分析是和膳食攝入、營養健康息息相關的一個領域，對生命科學和臨床醫學研究意義重大。近年來脂肪酸組分分析方法的研究已取得諸多進展，但在數據分析與整合(不同研究之間、不同人群之間)及與疾病因果關系的探討等方面仍面臨挑戰。為此，首先要開發選擇性好、效率高、穩定性強的衍生化技術，在脂肪酸中引入易電離的特定基團，能夠減弱其極性、增強其揮發性并產生特征化的離子。

　　其次，要開發脂肪酸內源性血漿/血清的質量控制樣品和對照品，實現不同檢測系統之間的可比性。從公共衛生角度講，科學、有效的脂肪酸組分分析方法能有效地推動國家水平脂肪酸參考值范圍的建立、實現某些疾病早期臨床診斷的生物標志物篩選、指導公眾脂肪酸合理攝入，為促進人類健康提供有力的科學支撐。

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　　作者：馬妍，陳晨，霍軍生

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