氧化石墨烯對擬南芥生長的促進作用

　　摘要：明確氧化石墨烯(grapheneoxide，GO)對擬南芥生長的促進作用，為納米材料應用于農業生產提供理論依據。采用不同濃度GO的1/2MS培養基點擬南芥種子，測定其主根長、側根數、根系活力、超氧陰離子自由基的產生、超氧化物歧化酶活性、根系生長相關基因的表達情況。經20~200μg/mLGO處理后，擬南芥主根長度比對照(不加GO)提高了4.6%~43.0%，在50~200μg/mL內，與對照相比，差異達顯著水平。50μg/mL處理顯著促進了側根形成，側根數比對照增加了約27.1%，高于或低于50μg/mL則不利于側根的形成。表明50μg/mLGO對擬南芥的主根長和側根數均存在促進作用，同時還發現該濃度可以增加擬南芥根尖的分生區和伸長區的長度，而對根尖直徑和根冠長度無影響。氯化三苯基四氮唑(TTC)和四硝基氮藍四唑(NBT)組織染色法結果表明50μg/mLGO濃度處理提高了根系活力和超氧化物歧化酶活性及降低了超氧陰離子的產生�；�因表達分析顯示ADC1和DAR2表達量下調和IQM3表達量上調，從而促進了主根的伸長;ARF7、ARF19、ERFII-1和IQM3表達量上調，從而促進了側根數量的增加。50μg/mLGO處理可促進擬南芥根系的生長。根系活力的增加、超氧陰離子的減少及根相關基因的表達上調是GO促進根系生長的主要原因。

　　關鍵詞：擬南芥;氧化石墨烯;納米材料;根系生長;基因表達

　　納米材料具有優異的光學、電學、力學特性，在材料學、微納加工、能源、生物醫學和藥物傳遞等方面具有廣闊的應用前景[1]。石墨烯是目前常用的一種碳納米材料。氧化石墨烯(GO)是石墨烯的氧化物，也是一種碳納米材料，因其含氧官能團增多而使其性質較石墨烯更加活潑。碳納米材料已拓展至農業，它能影響植物生長和發育的過程及其生長的環境[2-5]。研究表明，它對植物生長有促進作用。如石墨烯碳納米材料能促進植物呼吸和根系生長，減少氨的揮發，提高產出率、保障安全生產等[6]。在肥料中添加石墨烯碳納米材料能提升肥料利用率、促進種子發芽和農作物生長[7]。

　　但是，也有納米材料抑制植物生長等負面影響的報道。如一定濃度的納米材料可降低發芽率、抑制植物生長甚至導致植物枯萎死亡;抑制蛋白質合成和細胞分裂甚至導致植物基因水平的損傷，對植物造成毒性效應[8]。還有研究報道納米材料對植物生長的影響效果和處理濃度之間關系密切，不同濃度的處理可能產生截然不同的結果[6-9]。目前，納米材料對植物生長影響的研究還處在初始階段，許多結論還不完善和統一，GO在植物方面的報道更少。擬南芥是一種模式植物，其生長周期短。

　　本研究選用GO納米材料，設置不同GO濃度培養擬南芥，測定其主根長和側根數等形態指標，以明確其影響效果與GO處理濃度的關系，確定促進生長的最適宜濃度。進一步分析擬南芥幼苗中超氧陰離子自由基(O2·-)的產生、超氧化物歧化酶(SOD)活性和根系活力等生理指標，再分析其對擬南芥根生長相關的基因表達情況，進一步明確納米材料GO對植物生長的影響及其內在機制，為其應用于農業生產提供理論依據。

　　1材料與方法

　　1.1材料

　　材料為擬南芥野生型(Col-0)，種子用70%乙醇和20%漂白劑進行表面消毒，無菌水清洗后將其點在方形培養皿(10cm×10cm)中萌發(滅菌的1/2MS固體培養基，含有0.8%瓊脂和1%蔗糖)。將10g氧化石墨烯(GO)粉末溶解于1L去離子水中，并滅菌。

　　將超聲處理1h的GO溶液與滅菌的1/2MS培養液混合，形成GO濃度分別為0、20、50、100和200μg/mL的培養基(下文簡稱GO/MS培養基)。在各培養基上分別播種30~40粒種子，重復3次，4℃放置2d，然后轉至20℃/22℃，16h(晝)/8h(夜)的光周期和100μmol/(m2·s)的光照強度下的人工氣候室(全友，南京)中生長。

　　1.2方法

　　1.2.1GO的形貌表征

　　首先在掃描電子顯微鏡樣品臺上貼好導電膠，然后將干燥好的GO貼在導電膠上，在電流約為4mA條件下將樣品噴金30~40s。在15kV加速電壓下，用掃描電子顯微鏡(SEM，ZEISSGeminiSEM300)觀察GO的表面形態，并拍照。將GO分散到水中，超聲分散30min，取5μL滴加到鍍有碳膜的銅網上，自然風干后用透射電子顯微鏡(TEM，TalosF200X)觀察GO納米結構。通過傅里葉紅外光譜法(FTIR，TENSOR27紅外光譜儀)對GO進行表征。FTIR測定紅外光譜波數范圍為500~4000cm-1。

　　1.2.2主根長和側根數的觀察對生長在不同濃度GO/MS培養基中6d的擬南芥植株進行拍照，并使用ImageJ1.53軟件測量主根長。對生長11d的擬南芥植株進行拍照(為便于保存，拍攝時已通過2.5%戊二醛固定)，并人工統計其側根數。

　　1.2.3主根根尖各部分大小的分析對生長在不同濃度GO/MS培養基中4d的擬南芥主根進行碘化丙啶(propidiumiodide，PID)染色，用激光共聚焦顯微鏡(Leica，SP8)拍攝其根部的不同區域，再用ImageJ1.53軟件測量分生區、伸長區、根尖直徑和根冠大小。

　　1.2.4SOD活性和根系活力的測定

　　采用四硝基氮藍四唑(nitrobluetetrazolium，NBT)和氯化三苯基四氮唑(2，3，5-triphenyl-2H-tetrazoliumchloride，TTC)染色法分別進行O2·-和根系活力的測定，所有的樣品均處理6d。CO2·-的測定是將擬南芥幼苗放在含1%NBT的20mmol/L磷酸鉀緩沖溶液中，抽真空后用蒸餾水洗去染液，用70%乙醇溶液90℃脫色20min，然后用立體顯微鏡(Leica，S8AP0)觀察并拍攝，擬南芥幼苗著色的深淺來表示O2·-產生的多少。根活力的測定是將根浸在2%TTC染液中，37℃放置5h，立體顯微鏡觀察并拍攝。根著色深淺表示根活力的高低。采用WST法測定SOD活性，樣品的提取及測定參照試劑盒(建成，南京)的說明書來進行。

　　1.2.5根生長相關基因表達

　　以生長在1/2MS(含有GO濃度為0和50μg/mL)培養基中的擬南芥為基因表達分析材料，分別選取6及11日齡的擬南芥用于分析其主根和側根生長相關基因的表達。樣品經液氮研磨，用TRIZOL法提取總RNA，利用cDNA合成試劑盒將總RNA逆轉錄為cDNA。以ACT2(At3g18780)為內參基因，參照Cao等[10]方法，通過熒光定量PCR分析其基因表達水平。1.2.6統計分析采用SPSS20.0和origin進行統計分析和作圖。采用Ducan檢驗法統計差異。試驗重復3次。

　　2結果

　　2.1GO的表征

　　GO呈膨脹狀態，由多個片層疊加而成，表面顯示有褶皺，原因主要是多層GO疊加之后及自然狀態下單層GO為保證狀態的穩定而自動成為褶皺結構。超聲后的GO以單片層或少數幾層疊加的形式存在，其特征峰出現在波長3237(O-H的伸縮振動)、1712(酯C=O的伸縮振動)和1041cm-1(C-O的伸縮振動)，均為GO的含氧官能團。

　　2.2不同GO處理濃度對擬南芥生長的影響

　　不同濃度GO培養擬南芥6d后，與對照相比，經GO處理的擬南芥主根長均明顯增長，分別提高了4.6%、43.0%、31.7%和30.5%，其中，經50μg/mLGO濃度處理的擬南芥主根最長，約為26.5mm。

　　隨GO處理濃度的增加，根長呈現有規律的變化，先升高，于50μg/mLGO濃度時達到最高，隨后又逐漸降低。表明GO對擬南芥主根的生長有促進作用，但作用效果與處理濃度有關，適宜的濃度效果最好，過高或過低都會降低其效果。因此，促進擬南芥主根生長的GO適宜處理濃度約為50μg/mL。不同濃度GO培養擬南芥11d后，觀測其側根的生長情況。

　　與對照相比，200μg/mL高濃度處理和20μg/mL低濃度處理會抑制側根數的形成，分別比對照減少了20.2%和24.0%;而50μg/mL中等濃度處理卻能夠顯著增加側根數，約增加了27.1%;另外，100μg/mL濃度處理則無顯著變化。表明不同濃度的GO對擬南芥生長可能會產生促進、抑制和無效3種情況，在一定程度上解釋了前人不同試驗結論的原因，不同濃度處理可以產生完全不同的結果。和主根一樣，促進側根生長的適宜濃度約為50μg/mL。

　　2.3GO對擬南芥根系生長的促進作用

　　用50μg/mLGO濃度培養擬南芥，測定其形態和生理生化等指標，進一步探討GO促進根系生長的內在機制。

　　2.3.1GO對擬南芥根區不同部位生長的影響50μg/mLGO濃度培養擬南芥4d后，測量其根尖不同區域的長度，發現GO處理后的擬南芥主根分生區和伸長區的長度顯著增加，但根尖直徑和根冠長度并無顯著變化。表明GO主要是通過分生區和伸長區而促進根系生長。

　　2.3.2GO對擬南芥超氧陰離子自由基、SOD活性和根系活力的影響

　　通過TTC和NBT對組織進行染色，進一步分析GO處理對擬南芥幼苗中的超氧陰離子自由基O2·-水平和根系活力造成的影響。TTC染色法是常用的鑒定根系活力的方法。在GO/MS培養基中生長6d擬南芥的主根經TTC染色，發現50μg/mLGO處理植株的顏色明顯深于對照組，組織著色越深表明根系活力越強;反之，根系活力越弱。

　　表明適宜的GO濃度可以提高擬南芥的根系 活力。經50μg/mLGO處理的擬南芥幼苗顏色較淺，而對照植株的顏色相對較深。表明適宜的GO濃度處理提高了擬南芥幼苗中SOD的酶活性，從而減少了超氧陰離子自由基水平。此外，通過WST法對SOD活性進行了定量分析，發現經50μg/mLGO處理的擬南芥幼苗的SOD活性顯著高于對照，其活性約增加43.6%。這印證了NBT的染色結果。

　　2.3.3GO對擬南芥根生長相關基因表達的影響

　　通過對不同濃度GO處理下擬南芥根相關基因的表達檢測。與對照相比，ADC1和DAR2的表達量下調，而ERFII-1的表達量則變化不大，IQM3的表達量上調，且達到顯著水平。表明在GO的影響下，可導致ADC1和DAR2下調和IQM3上調，進而促進了根長的增加。與對照相比，側根生長相關的基因ARF7、ARF19、ERFII-1和IQM3的表達量在GO處理后都表現為顯著上調，分別增加了150.0%、51.0%、312.0%和83.0%，CKX1的表達量則沒有明顯改變。表明適宜濃度GO處理可使ARF7、ARF19、ERFII-1和IQM3的表達量上調，進而促進了側根數量的增加。

　　3討論

　　3.1不同GO濃度處理對植物生長的影響分析

　　本研究結果表明，在20~200μg/mL濃度處理范圍內，隨著GO濃度的增加，對擬南芥主根長均表現為促進作用，20μg/mL處理促進作用不明顯，但隨著濃度增加促進效果增強，到50μg/mL時促進作用達到最大，然后隨濃度升高促進效果下降，但50~200μg/mL濃度促進作用均達到顯著水平;GO對側根生長的影響則是20μg/mL低濃度處理和200μg/mL高濃度處理均會抑制側根數的形成，而50 μg/mL中等濃度處理卻能夠顯著增加側根數。

　　如果將抑制作用理解為促進作用的負增長，則GO影響主根和側根生長的濃度響應趨勢非常類似，先是隨著處理濃度升高而促進作用效果增加，達到一個峰值后濃度增加而其效果則下降。無論是主根還是側根，50μg/mL濃度處理促進生長的效果最好。本研究明確了GO處理對擬南芥生長的影響，但作用效果與處理濃度顯著相關，不同的處理濃度可能會產生促進或抑制完全相反的2種效果。

　　本研究中，GO處理對主根生長沒有產生抑制效果，可能是由于濃度范圍設置過窄，沒有達到抑制主根生長的處理濃度，根據處理產生的效果趨勢，如果繼續增加處理濃度，很可能會出現抑制主根生長的處理效果，有待進一步試驗驗證。Park等[9]也證實了GO可促進擬南芥的生長，但其試驗濃度和效應與本研究結果不一致。認為GO濃度為0.1μg/mL時可促進擬南芥葉面積的增加，在0.1~1.0μg/mL范圍內可促進開花的數量，但對根的長度沒有影響。造成這種差異的原因可能是不同器官對GO處理的響應濃度不同，根系需要更高的濃度處理。Park等[9]的GO處理最高濃度僅為1.0μg/mL，可促進花和葉的生長，卻不能影響根的生長。

　　本研究增加處理濃度，可以明顯看到GO處理對根系生長的影響。所以，同一植物的不同器官對GO處理的響應濃度是不一樣的。GO對植物的影響，還與植物的種類有關，不同種類的作用效果和響應濃度不同。有研究表明，經5和50mg/L的石墨烯處理的水稻根長與對照組并無明顯差異，而在100和200mg/L的處理中則表現為抑制，沒有顯示石墨烯處理對其生長的促進作用[11]。另有研究表明，10μg/mL的GO處理促進了西瓜的生長，增加了其周長，并能增強植物的穩定性[9]，與本研究結果相比，促進西瓜生長的GO處理濃度要低。

　　4結論

　　GO是一種重要的碳納米材料，能促進擬南芥根系生長，但作用效果和處理濃度顯著相關。在本試驗條件下，50~200μg/mL處理顯著促進擬南芥主根的伸長;50μg/mL濃度處理顯著促進擬南芥側根數的形成，但20μg/mL低濃度處理和200μg/mL高濃度處理會抑制側根數的形成。

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　　作者：高聰 蕭楚健 魯帥 王蘇蓉 袁卉華 曹云英

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