本文摘要：摘要近年來，熒光顯微鏡技術由于其良好特異性、高對比度、高信噪比等性能優勢，被廣泛應用于生物物理學，神經科學，細胞學，與分子生物學等生命科學研究的各個領域。然而，傳統的熒光顯微鏡仍然存在分辨率、成像速度、成像視
摘要近年來，熒光顯微鏡技術由于其良好特異性、高對比度、高信噪比等性能優勢，被廣泛應用于生物物理學，神經科學，細胞學，與分子生物學等生命科學研究的各個領域。然而，傳統的熒光顯微鏡仍然存在分辨率、成像速度、成像視場、光毒性和光漂白等方面的相互限制，使其在亞細胞結構觀測、活體生物超精密成像和分子結構研究領域的應用受到了極大阻礙。由于傳統熒光顯微鏡所具有的光學系統的局限性，研究人員將目光投向了由數據驅動的深度學習方法�；谏疃葘W習顯微鏡的出現，豐富了現有的光學顯微成像技術，大數據量的訓練突破了傳統光學顯微鏡所能夠達到的功能和性能的疆界。本文聚焦深度學習的熒光顯微成像技術，首先對深度學習的基本原理以及發展過程進行了簡要概述，隨后針對深度學習在熒光顯微成像領域近年來國內外的最新成果進行了總結，通過與傳統顯微成像系統的對比，闡述了深度學習在解決熒光顯微成像問題上的優越性，最后對深度學習在顯微成像技術上的應用前景進行了展望。
關鍵詞深度學習;熒光顯微鏡;超分辨;光學成像
1引言
2014年諾貝爾化學獎授予了超分辨熒光顯微技術，標志著光學顯微鏡的分辨率由亞微米級進入納米級。熒光顯微鏡是生命科學中研究細胞、組織和生物體時空動力學行為不可或缺的工具。現有的熒光顯微鏡[1-8]將成像分辨率從幾百納米提高至幾納米，實現了生物精細結構與精細動態過程的高分辨體成像[9-19]。然而，記錄生物過程的質量不僅取決于光學設備的空間分辨率[20]，還取決于時間分辨率、實驗總持續時間、成像深度、可達到的熒光團密度、光漂白性和光毒性等[20-29]。
而受樣本健康和最大光子預算限制，上述因素存在相互制約關系，不可能同時優化。例如，通過減少曝光時間提高成像速度的同時犧牲信噪比。因此，熒光顯微鏡在亞細胞結構觀測、活體生物超精密成像和分子結構研究領域的應用上仍存在一定缺陷。
目前，針對上述缺陷主要有兩類解決方法。第一類方法是優化顯微鏡硬件[30-36]。第二類方法是使用提高獲取顯微圖像質量的算法與光路配合，優化提取信息的效率[37-42]。由于物理條件的限制，光路硬件優化很難突破。因此計算算法已日益成為成像過程的重要組成部分。圖像重建算法的突破不僅能提高圖像質量，還將為開發新的成像模式提供思路[43]。常見圖像重建算法包括基于熒光分子物理特性的統計超分辨算法[44-49]、基于相應成像模型的反卷積算法[50-54]、基于形態學模型的表面投影算法[55,56]和基于數據驅動的深度學習算法[57,58]等。
上述算法均可以巧妙地繞過物理限制，在一定程度上克服熒光顯微鏡的缺陷，更好地恢復生物信息。相比于其他算法，深度學習能夠更充分利用現有數據的先驗知識，針對于特定任務的信息恢復能力更強[43];深度學習利用神經網絡進行數據驅動的統計推斷，不需要對成像過程進行數值建�；蚬烙孅c擴散函數;深度學習可以實現端到端的圖像轉換，不需要顯式的分析建模;深度學習預訓練好的深層網絡無需任何迭代或參數搜索即可快速實現高性能顯微功能及其大眾化。基于上述優勢，深度學習已成為彌補熒光顯微鏡缺點的一種有效方法。
本文聚焦于深度學習熒光顯微成像技術，旨在幫助研究者們了解深度學習熒光顯微成像技術的基本知識、應用和發展趨勢，為該領域科學研究提供參考。首先簡介了深度學習基本原理;其次分析了幾種典型的熒光顯微鏡的主要缺陷，并通過舉例方式闡述深度學習在解決熒光顯微成像問題上的優越性;最后總結了深度學習仍存在的問題并對深度學習顯微成像領域未來發展趨勢進行了展望。
2深度學習原理
2.1深度學習基本概念及其發展歷程
深度學習是隸屬于機器學習算法的一項新興技術，其發展是由用于人腦分析學習的神經網絡的建立和仿真所推動的。傳統的學習算法大多屬于簡單學習，只具有淺層結構，一般僅包含一兩層非線性特征變換層，很難解決一些復雜的自然信號處理問題[59-63]。深度學習通過學習深度非線性網絡結構來表征輸入數據，能夠實現對復雜函數的逼近，具有直接從樣本集學習整體數據集本質特征的強大能力，更加適用于計算機視覺領域，能夠用于解決熒光顯微成像領域一系列傳統熒光顯微鏡無法克服的問題。深度學習的發展迄今為止經過了三次浪潮，跌宕起伏，總的來說可以分為：1943-1969年為起源階段，在此期間各種人工智能的概念被相繼提出[64-68]。1974-2006年為發展階段，具有代表性的技術，如反向傳播算法、循環神經網絡、卷積神經網絡等深度生成架構逐步成型[69-79]。
2006年-至今為爆發階段，深度學習在科學與技術的各個領域開始廣泛應用[80-86]。起源階段：1943年隨著McCulloch&Pitts神經元模型的提出[64]，人工神經網絡的研究由此開始。隨后，“感知器”的提出[66]引起了第一次神經網絡的浪潮。然而，1969年美國數學家M.Minsky提出了單層感知器無法解決線性不可分問題[68]，使人工神經網絡的發展陷入了停滯。發展階段：1986年G.E.Hinton教授提出的適用于多層感知器的反向傳播算法(BP算法)[76]，有效解決了非線性分類和學習的問題，人工神經網絡進入發展階段，多種模型被陸續提出。
然而，1991年BP算法被指出存在梯度消失問題，阻礙了其有效地學習數據分布，人工神經網絡的發展陷入了二次停滯。爆發階段：2006年G.E.Hinton教授針對深層網絡訓練中梯度消失問題提出了解決方案，并正式提出“深度學習”的概念[80]。隨后，2012年提出的AlexNet模型以及2015年提出的ResNet模型[83]由于在ImageNet競賽中的優異表現，得到了人們的廣泛關注，深度學習進入爆發階段。隨著深度學習的不斷發展，深度學習開始在各個領域被廣泛應用，深度學習顯微成像技術應運而生。
2.2深度學習方法
2.2.1監督學習監督學習是目前最常見的機器學習類型[87]，輸入是有人工標注的樣本，通過調整分類器的參數，實現輸入數據到已知目標輸出的映射。監督學習主要包括分類和回歸。在分類問題中，深度學習網絡預測離散值并將輸入變量與離散類別關聯。在回歸問題中，深度學習網絡使用連續函數將輸入與輸出關聯。
2.2.2無監督學習無監督學習是指在沒有人工標注(標簽)的情況下，通過計算機學習去自動尋找輸入數據間的關系[88]。目前無監督學習主要用于數據可視化、數據壓縮以及數據去噪。其中，降維和聚類是目前最流行的兩種無監督學習方法。
2.2.3強化學習
強化學習[89]使用獎懲系統預測學習模型的下一步，用于解決智能體在與環境的交互過程中通過學習策略以達成回報最大化或實現特定目標的問題。強化學習的常見模型是標準的馬爾可夫決策過程，主要用于解決游戲和機器人中常見的決策問題。強化學習可分為基于模式的強化學習和無模式強化學習，以及主動強化學習和被動強化學習。求解強化學習問題所使用的算法可分為策略搜索算法和值函數算法兩類。
2.3深度學習架構
隨著近年來深度學習的發展，人工神經網絡的發展也獲得了重大進展，產生了豐富的深度學習架構。在眾多深度學習框架中，深度學習熒光顯微成像領域沿用了許多計算機視覺領域表現出色的網絡架構并對其進行優化與創新。
2.3.1卷積神經網絡
深度卷積神經網絡(ConvolutionalNeuralNetworks，CNN)是計算機視覺領域最廣泛應用的網絡[70]，具有權重共享、局部區域感知以及空間或時間上池化降采樣三大特點，因此網絡模型在結構上更加簡單，大大減少了網絡中的權值數量。上述特點也使得CNN網絡在面對數據量龐大的圖像識別問題時可以通過降維方法解決問題，在視覺識別任務中表現出色，被廣泛應用到顯微成像領域[90-96]。
3深度學習在熒光顯微成像中的應用
光學顯微成像技術本身具有高分辨率、高通量(高速)、非侵入、低毒性等特點，與熒光蛋白以及熒光染料等標記物在細胞中的定位與表達技術相結合，使得科學家可以特異性的分辨生物體乃至細胞內部不同結構與成分，并且能夠在生命體和細胞仍具有活性的狀態下對其功能進行動態觀察。
典型的熒光顯微系統主要有基于掃描照明的光片熒光顯微成像，共聚焦熒光顯微成像，基于寬場照明(非掃描)的寬場熒光顯微成像和光場熒光顯微成像，采用了超分辨技術的結構光照明熒光顯微成像、受激發射損耗顯微成像、單分子定位熒光顯微成像。2017年美國加州大學洛杉磯分校A.Ozcan課題組在《Optica》上發表文章[115]，第一次將深度學習技術應用于寬場顯微圖像轉換中，并用卷積神經網絡訓練數據集，顯著改善了寬場顯微鏡的性能，提高了在大視場和景深范圍內的空間分辨率，開啟了將深度學習與顯微成像相結合的新時代。
3.1共聚焦熒光顯微成像
共聚焦熒光顯微鏡[116]用高度聚焦的激光束對樣品逐點掃描成像，熒光信號經過探測針孔濾波后被光電倍增管收集。由于針孔結構，只有激光焦點處激發的熒光可以通過探測針孔，有效的濾除了離焦信號，而且通過逐層掃描樣品，可實現三維成像。與普通寬場或點掃描熒光顯微鏡相比，共聚焦顯微鏡具有更高的信噪比和分辨率。然而，共聚焦熒光顯微鏡采用點掃描方式成像，需要逐像素掃描，原理上速度慢。并且共聚焦熒光顯微鏡采用大功率激發光聚焦照明，獲得高信噪比圖像的同時相比于傳統顯微鏡光漂白性和光毒性更加嚴重。
與傳統點掃描共聚焦熒光顯微鏡相比，轉盤共聚焦熒光顯微鏡采用多點并行掃描方式，速度快，但信噪比較低，分辨率不如點掃描共聚焦且仍存在光漂白性和光毒性嚴重的問題。M.Weigert等人在2018年提出了基于深度學習的內容感知圖像恢復網絡(Content-awareImageRestoration，CARE)，更好地解決了轉盤共聚焦熒光顯微鏡光漂白性和光毒性嚴重的問題。CARE使用U-Net類3D網絡，在采集過程中光子數量減少60倍的情況下將低信噪比轉盤共聚焦熒光顯微圖像恢復為高分辨顯微圖像，實現了更適合生物樣本活體狀態下的成像[98]。
4深度學習顯微成像的發展趨勢
深度學習顯微鏡的出現豐富了現有的光學顯微成像技術，解決了很多傳統光學在物理限制下無法輕易甚至不能解決的問題，然而這僅僅是實現革命性成像技術大工程中的一小步�，F今深度學習顯微鏡仍然存在一些問題：(i)訓練數據的獲取與標注成本高;(ii)電子硬件芯片資源昂貴且落地靈活性差;(iii)純依靠數據導致特定網絡訓練后缺乏泛化能力;(iv)學習器的拓撲結構設計與學習的內在過程的可解釋性不足。上述因素均限制了深度學習顯微鏡的進一步發展[129-131]。
光學論文范例： 影響X熒光光譜儀測量準確度的幾個因素分析
5結束語
本文介紹了深度學習熒光顯微成像技術的基本概念，列舉了共聚焦顯微鏡、光片顯微鏡、光場顯微鏡、結構光顯微鏡、受激發射損耗顯微鏡以及單分子定位顯微鏡與深度學習結合的一系列應用實例，最后對于深度學習顯微成像的發展趨勢進行了展望。深度學習的發展雖有過曲折，但是深度學習的出現不可否認的為許多領域帶來了眾多令人矚目的開創性研究成果。我們有理由相信人工智能未來的發展將會迎來更好時代，現在正處于深度學習的第三次發展浪潮，應努力致力于深度學習技術和顯微成像技術的結合應用。另一方面，深度學習也還有很長的路要走，當下深度學習技術在光學顯微成像領域所面臨的挑戰也是正要面對和解決的問題，同時也應當注重光學原理以及硬件的創新和提升，未來顯微鏡的發展必將依靠新型光學系統與高效深度學習算法的融合，我們期待出現更多革命性的顯微成像技術。
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作者：李浩宇，曲麗穎，華子杰，王新偉，趙唯淞，劉儉
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