本文摘要：摘要背景：牙囊干細胞作為牙源性間充質干細胞的一種，其優良的特性使其在細胞治療以及組織工程方面具有良好的應用前景和臨床轉化價值。目的：綜述牙囊干細胞的基本特性及其在牙及牙周復雜組織結構再生修復領域的最新進展。方法：以dentalfolliclestemcell，regeneratio
摘要背景：牙囊干細胞作為牙源性間充質干細胞的一種，其優良的特性使其在細胞治療以及組織工程方面具有良好的應用前景和臨床轉化價值。目的：綜述牙囊干細胞的基本特性及其在牙及牙周復雜組織結構再生修復領域的最新進展。方法：以“dentalfolliclestemcell，regeneration，tooth，bone，periodontaltissue，tissueengineering，review”及“牙囊干細胞，再生修復，牙，骨，牙周組織，組織工程，綜述”為關鍵詞，檢索PubMed、Sciencedirect、Medline、CBM、CNKI等數據庫2010-2021年發表的文獻，最后納入61篇文獻進行分析與討論。結果與結論：牙囊干細胞作為牙源性間充質干細胞，在口腔再生醫學領域擁有極大的應用價值，其具有來源豐富、多向分化、低免疫原性等特點。目前牙囊干細胞正積極應用于牙周缺損再生修復、組織工程生物牙根重建以及牙槽骨修復研究，近年來在其他組織損傷和免疫系統疾病的治療潛能也被不斷挖掘。但在更深入的臨床應用之前，如何更好地調控牙囊干細胞的功能機制以及控制免疫系統反應，以進一步優化牙及牙周組織的構建方法，值得深入研究和探討。
關鍵詞：干細胞;牙囊干細胞;再生;修復;牙;骨;牙周組織;組織工程;綜述
0引言Introduction
牙囊是來源于外胚間充質組織的疏松結締組織囊，主要由牙囊干細胞組成，可分別形成牙槽骨、牙周膜、牙骨質。牙及牙周組織由于發育缺陷、創傷或感染性疾病等原因而受到不同程度的損傷，如何有效且穩定地恢復患者原有的局部組織形態與器官功能等問題，給學者們帶來了全新的挑戰。組織工程的理論實踐研究正得到不斷的發展與成熟[1]，尋求合適的種子細胞以及細胞在植入組織后的有效作用體系是實現牙及牙周再生的關鍵。近年來，牙囊干細胞在再生醫學領域得到了充分的探討，其組織重建研究已經從體外實驗發展到動物模型實驗。
牙囊干細胞具有易于規�；瘮U增、來源豐富、免疫調節力強和多向分化潛能等特點，在異體細胞移植方面占有一定優勢。已有研究利用牙囊干細胞復合生物支架構建出了生物牙根[2];另外，通過其自身的成骨分化潛能促進牙槽骨組織再生的效果也較理想[3];牙囊干細胞還能在炎性微環境的刺激下快速增殖，具有較低的免疫原性和組織相容性，并促進牙周缺損動物模型再生出新的牙周復合體，實現了牙周“三明治結構”的重建[4]。由此看來，牙囊干細胞擁有良好的臨床轉化價值。不僅如此，牙囊干細胞還可通過釋放細胞因子、趨化因子對炎癥免疫反應起到調節作用。因此，文章就牙囊干細胞的特性作出多方面闡述，重點介紹其在牙及牙周組織再生中的研究現狀和最新進展。
1資料和方法Dataandmethods
1.1資料來源
以“dentalfolliclestemcell，regeneration，tooth，bone，periodontaltissue，tissueengineering，review”及“牙囊干細胞，再生修復，牙，骨，牙周組織，組織工程，綜述”為關鍵詞，檢索PubMed、Sciencedirect、Medline、CBM、CNKI等數據庫，設置檢索時間段為2010-2021年，最后對納入的61篇文章進行結果討論與分析。
1.2文獻選擇標準納入標準：同一研究領域中論點、證據可靠的文獻;與該綜述內容相關的文獻。排除標準：重復性研究;無法提取的文獻;資料陳舊的文獻。
1.3資料提取與文獻質量評價檢索中英文文獻637篇，根據納入標準進行篩選，通過閱讀各文章全文，排除無相關性、資料陳舊或內容重復的文章，最終選入61篇文獻進行綜述。
2結果Results
2.1牙囊干細胞
2.1.1牙囊干細胞表面標志物
牙囊干細胞呈長梭形，類似成纖維細胞的形態;可從尚未長出的第三磨牙的牙囊組織中分離提取出來，其具有較高的細胞增殖率;經特定的冷凍保存劑可長期穩定保存[5]。研究表明，在輕度熱應激的條件下，即保持39℃或40℃的培養溫度，可有效促進其成骨分化以及增殖[6]，這一發現將有利于制定適宜的培養條件并用于加快牙囊干細胞的體外擴增與分化。
牙囊干細胞具有間充質干細胞的表型特征，常見的表面標志物如表達低水平的CD34[7]、CD44、CD90、CD105、CD45、CD31和高水平的CD29，而HLA-DR、TEP-1、SOX-2和OCT-4呈陽性表達[8];LIMA等[9]通過實驗發現牙囊干細胞群不僅表達胚胎干細胞、間充質干細胞標志，而且有p75(50%)、HNK1(<10%)和少量膠質纖維酸性蛋白陽性細胞(<20%)，這也是首次發現在牙囊中存在神經干細胞和膠質樣細胞的研究。
此外，牙囊細胞還表達牙周膜和牙骨質標志物[10]，如牙骨質蛋白1、牙周膜相關蛋白1、成纖維細胞生長因子2以及牙周膜相關蛋白1。高表達的Noch-1在牙囊細胞發育過程中起重要作用，Noch-1信號通過調節細胞周期和端粒酶活性而促進其自我更新和增殖[11]。相對于牙周膜干細胞，牙囊干細胞顯示出更出色的抗氧化防御能力[7]，在比較牙囊前體細胞和牙周膜干細胞的骨形成相關基因甲基化特征時，后者顯示出更高的成骨相關因子轉錄水平以及更多的體內新骨形成[12]。
2.1.2牙囊干細胞多向分化潛能
牙囊干細胞具有成骨、成牙骨質、成脂肪和成神經等分化潛能。當在適宜的培養條件下，其具有較強的成骨能力，成骨分化細胞在體外形成礦化結節，成骨標志物Runt相關轉錄因子2、Ⅰ型膠原和堿性磷酸酶等顯著增加[13]，且在培養時使用軟質的彈性基質可更支持其成骨分化[14]。
BMP、Noch、Hedgehog、WNT等成骨相關通路，對牙囊干細胞的調控可通過BMP2/DLX3整合環來實現。Wnt信號在間充質干細胞的增殖分化與遷移歸巢中扮演著重要角色，經典的Wnt通路抑制牙囊干細胞成骨分化過程，而β-連環蛋白通過激活蛋白激酶A來支持BMP2/DLX3介導的成骨分化[16]。Wnt5a顯著增加了RANK配體依賴的破骨細胞分化，并可能參與牙槽骨再生或吸收[17]。
研究指出在牙囊干細胞中存在由ZBTB16調控的非依賴性Runt相關轉錄因子2成骨分化機制[18]，ZBTB16誘導牙囊干細胞晚期成骨分化標志物的表達，但不誘導Runt相關轉錄因子2和堿性磷酸酶的表達[19];有研究檢測成骨分化過程中差異表達的circRNAs，發現circFgfr2在成骨分化過程中起正調節作用，miR-133表達下降，而Bmp6表達升高[20]。另外，在dNCPs/DFCCM處理的牙囊干細胞中，可發現高表達的礦化相關標志物以及成牙骨質細胞系特異性標志物[21]，即這些細胞沿成牙骨質細胞譜系分化。
來源于顱神經嵴的牙囊干細胞可能是神經組織工程的種子細胞，具有修復脊髓全橫斷損傷和促進功能恢復的潛能[22]。多年來學者們對牙囊干細胞衍生的神經譜系的研究相對較少，YANG等[23]對比不同細胞在不同神經誘導分化方式下神經標志物基因的表達，發現用神經培養基、表皮生長因子和堿性成纖維細胞生長因子培養后的神經分化潛能更高;但目前的研究缺乏神經分化細胞的具體功能評估。
在2017年，XU等[24]研究表明人牙囊來源上皮細胞在體外三維誘導條件下能分化為唾液腺腺泡細胞和導管細胞，將其負載于脫細胞大鼠腮腺支架，移植到裸鼠腎包膜中可以向涎腺樣細胞分化。除此之外，有報道稱牙囊干細胞可誘導分化為功能性肝細胞，并有某些肝細胞功能[25];也可通過STAT3信號通路調控肝細胞生長因子受體表達并促進其向肝細胞分化和發育成熟[26]�？偟膩碚f，在多種因素的影響下牙囊干細胞具有豐富的分化潛能。盡管如此，仍需不斷探索牙囊干細胞定向分化的調控機制以提高其實用性與可控性。
2.1.3牙囊干細胞的其他特性
牙囊干細胞除了其本身顯著的再生潛能以外，在免疫調控與治療方面也有著不可或缺的作用。牙囊干細胞移植后與細胞外基質相互作用，能控制炎癥或排斥反應。牙源性間充質干細胞的免疫調控方式包括抗炎和促炎兩個方面[27]。有學者利用MuSK免疫小鼠經靜脈注射牙囊干細胞，結果顯示小鼠的實驗性自身免疫性重癥肌無力的發生受到抑制，疾病嚴重程度也降低，血清內抗Musk抗體、NMJ、IgG、C3沉積水平和CD11b+淋巴細胞均顯著降低[28]，并表明牙囊干細胞主要抑制機體天然免疫系統從而發揮作用。
牙囊干細胞還在一定程度上保護腸道組織，TOPCUSARICA等[29]構建盲腸結扎穿孔誘導的膿毒癥小鼠模型，局部注射牙囊干細胞通過降低腫瘤壞死因子α和增加Treg細胞比例來控制腸道組織的炎癥反應。有學者發現牙囊干細胞抑制了哮喘患者的CD4+T淋巴細胞的增殖反應，增加Treg細胞比例，通過吲哚胺2，3-雙氧酶和轉化生長因子β途徑降低白細胞介素4、GATA結合蛋白3的表達，并上調干擾素γ、T-bet和白細胞介素10的表達[30]，可見牙囊干細胞與其分泌因子相互作用于各種炎癥環境發揮其免疫調控功能，提示其有望用于某些免疫以及炎癥性疾病的治療。
牙囊細胞的組織工程應用不僅體現在促進口腔頜面部軟硬組織的重建，而且對神經或其他組織損傷也顯示出應用前景，LI等[31]將人牙囊細胞結合于聚己內酯/聚乳酸-羥基乙酸共聚物材料修復小鼠脊髓缺損，結果發現其促進了髓鞘再分化的少突膠質細胞系標志物Olig2的表達。在2016年，SUNG等[32]嘗試用琥珀酰苯胺異羥肟酸(SAHA)誘導的方法，將其加入體外牙囊干細胞培養基中，結果成功誘導其向心肌細胞分化，且將誘導的心肌細胞注射入動物體內，可在心臟內穩定生存，且炎癥反應輕微，這表明牙囊干細胞也有治療某些心臟疾病的潛力。
2.2牙囊干細胞與牙及牙周組織再生修復
2.2.1牙本質及牙髓的再生修復
局部病變可導致牙髓功能喪失或整個牙齒的缺失，目前傳統的牙髓治療手段以及常規義齒修復方式都難以恢復患者天然牙原本的生理功能，隨著組織工程的高速發展，逐漸為牙本質和牙髓再生提供了可能。首先，HONG等[33]觀察大鼠牙囊干細胞條件培養液對脂多糖誘導的大鼠牙髓炎癥細胞的炎癥控制作用時，發現該條件培養基通過下調ERK1/2和NF-κB信號通路，抑制促炎性細胞因子白細胞介素1β、白細胞介素6和腫瘤壞死因子α的表達，而促進白細胞介素4和轉化生長因子β的表達，由此可利于牙髓的修復。
人牙本質基質可結合牙囊干細胞用于牙本質及牙髓的再生，LI等[34]發現與磷酸鈣組相比，牙囊干細胞在人牙本質基質上黏附生長，表現出良好的生物相容性，并可在免疫缺陷小鼠背部誘導并支持完整牙本質組織的再生，經檢測有牙本質標志物牙本質涎蛋白和牙本質基質蛋白1的表達。同樣有學者報道，相較于牙周膜干細胞，牙囊干細胞表現出更強的增殖能力和分化潛能，經牙本質基質支架誘導并移植入小鼠背部皮下，牙囊干細胞則顯示出更顯著的牙本質形成能力[35]。
在此過程中，如利用抗氧化劑叔丁基對苯二酚處理同種異體牙囊干細胞復合的異種牙本質基質支架，可在一定程度上減少牙本質再生過程中破骨細胞的生成與吸收[36]。此外，低溫保存的牙本質基質也可以為牙囊干細胞再生牙本質組織提供良好的生物支架和穩定的誘導微環境，這主要因為其孔徑較大，搭載細胞時能釋放更多的牙本質形成相關蛋白，誘導過程也可形成如牙本質小管、前牙本質、膠原纖維等組織[37]。
牙根承載咬合力及維持著牙齒整體功能穩定，而牙本質作為牙齒的重要支撐結構，再生出牙本質組織對生物牙根再生至關重要。YANG等[38]將牙囊干細胞復合牙本質基質植入小鼠背部皮下，發現形成新的牙本質牙髓樣組織和牙骨質牙周復合體，且新形成的組織中Ⅰ型膠原、巢蛋白和Ⅷ因子、牙本質涎蛋白和牙骨質附著蛋白等標志物呈陽性表達，表明成功再生出牙本質及牙根樣組織。
此外，GUO等[39]將牙囊細胞聯合牙本質基質植入牙槽窩4周后，發現有牙髓及牙周組織表面標記物染色陽性的根狀組織再生，提示牙囊細胞與牙本質基質的聯合應用對牙根再生治療的重要意義;此后，將上述二者結合進行異種生物牙根動物模型實驗表明，促炎癥細胞因子白細胞介素6及轉化生長因子β的基因表達均有不同程度降低(P<0.01)，而且相比對照組，植入4周后抗酒石酸酸性磷酸酶染色陽性的破骨細胞明顯減少，說明細胞發揮免疫調節作用有利于局部牙本質的再生[40]。
為構建合適的微環境，研究者們考慮將多種生物材料制劑、三維細胞培養等技術應用于牙本質再生[41]，但需要更深入的研究以獲得更理想的效果。如何保證牙囊干細胞介導新形成的牙本質擁有充足的血液供應和神經支配等問題仍需要進一步解決，作為種子細胞之一的牙囊干細胞值得學者們深入研究與探討。
2.2.2牙槽骨的再生修復
多種誘因包括發育畸形、炎癥、創傷、頜骨及軟組織腫瘤等，可導致牙槽骨缺損，進而影響患者咀嚼、吞咽、言語表達等正常生理功能，影響生活質量。目前學者們利用干細胞移植的方式無疑為修復牙槽骨缺損提供了全新的方向。牙囊干細胞聯合其他細胞可充分利用組織工程的優勢，有學者通過牙髓干細胞與牙囊干細胞共培養結合動物模型研究，證明牙髓干細胞可促進牙囊干細胞的成骨細胞分化和抑制破骨細胞的生成，表現為骨形態發生蛋白2、骨涎蛋白、骨鈣素等成骨相關基因的表達水平明顯升高，而核因子κB受體活化因子配體表達降低[42];而且在赫特維希上皮根鞘細胞和牙髓干細胞同時存在的情況下，可在動物體內將牙囊干細胞定向分化為成骨或成牙骨質細胞[43]，這為再生牙槽骨提供了新思路。
對于牙源性間充質干細胞而言，通常需要結合細胞支架材料才能在組織內更好的黏附增殖與高效成骨;研究者們根據牙囊干細胞的特性選用了多種類型的支架材料，利用明膠海綿在三維結構下培養牙囊干細胞[44]，在移植入免疫缺陷大鼠顱頂之后，相比對照組，未加地塞米松成骨誘導的牙囊干細胞移植后骨質量和骨密度(P=0.039)、骨礦含量(P=0.006)、骨體積(P=0.002)，骨礦含量/總容積(P=0.006)，骨體積/總容積(P=0.002)均明顯增高。與此同時，有學者發現在體外培養條件下，與對照組相比，牙囊細胞在磷酸三鈣培養基上有較強的細胞黏附與增殖能力，且磷酸三鈣可刺激成骨分化，成骨細胞標志物骨涎蛋白高度表達，而標準培養基中分化的牙囊細胞則幾乎不表達[45]。
磷酸三鈣雖然會誘導牙囊細胞凋亡，但同時也刺激了牙囊細胞抗凋亡基因的表達和成骨分化標志物的表達[46]，這可能不會損害細胞的增殖和成骨分化能力。近年來納米材料在骨再生領域中表現出重要作用，其中納米羥基磷灰石/纖維素支架促進人牙囊細胞的黏附增殖[47]，且無細胞毒性;氧化石墨烯以及氮摻雜石墨烯納米材料也有良好的效果[48]，具體表現在對人牙囊干細胞毒性較低和對線粒體損傷小，后者在低質量濃度(4mg/L)時表現出良好抗氧化能力以及安全性。牙囊干細胞結合聚己內酯支架修復免疫抑制小鼠顱骨缺損，通過斷層掃描和組織學分析，可觀察到骨再生，而未移植的空白對照組未觀察到骨再生[49]。
3總結與展望Summaryandprospects
綜上所述，隨著對牙囊干細胞研究的進一步深入，其被認為是良好的種子細胞來源。首先，如何再生出牙周“三明治結構”是口腔醫學領域研究者們棘手的難題，由于牙周組織結構的特異性、局部炎癥微環境以及不同患者體內免疫特性等因素的影響，牙囊干細胞介導的牙周重建策略仍面臨著諸多挑戰，例如：如何對牙囊干細胞的衰老、增殖和遷移特性進行有效調控;另外，如何控制干細胞某些基質成分的合成分泌，以模擬和維持牙周組織的天然微環境;而且，在移植后是否促進了特定內源性牙源性干細胞的激活還有待驗證。
總的來說，牙囊干細胞修復牙周組織的復雜機制還有待進一步研究。對于牙囊干細胞的微創牙髓治療和生物牙根再生，需明確其成牙定向分化的分子機制，還需重點關注影響干細胞生物學特性及功能發揮的基質微環境。牙囊干細胞的組織親和力受哪些分泌因子及信號通路的影響，以及無論是生物牙根還是牙周復合體的構建，成骨和破骨以及牙囊干細胞之間平衡的調節方法，都需要進一步探索，以提高細胞在生理結構不同愈合階段的修復效率。
此外，優化利用不同細胞相容性 的生物支架材料顯得十分必要，這不僅有利于為干細胞提供支持，也有利于臨床個性化治療，而對整個過程的控制和成本效益等問題也都是不容忽視的部分。牙囊干細胞的免疫調節作用有利于減輕干細胞植入的炎癥或排斥反應，且對某些免疫系統疾病也有重要價值，因此深入了解牙囊干細胞與機體之間的相互關系顯得至關重要。最后，基于牙囊干細胞的臨床應用仍在發展初期，屆時還需大量細胞、動物模型實驗的推進以加快臨床轉化，且人體的應用效果和安全性等還需大樣本、長期隨訪的臨床試驗開展以評定其可行性。通過完善研究，相信在不遠的將來牙囊干細胞會獲得更好的推廣和應用。
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作者：蒙盛子，劉蓉，羅雅馨，畢浩然，陳曉旭，楊琨
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