基于生物技術的農產品質量安全快速檢測方法研究進展

　　摘 要： 農產品質量安全快速檢測技術樣品前處理簡單， 對設備要求不高， 簡便快速， 是當前農產品質量安全監管工作的重要技術支撐。 本文綜述了基于生物技術的農產品質量安全快速檢測方法的研究進展， 包括酶抑制技術、 免疫學技術 (酶聯免疫吸附測定、 免疫層析、 生物芯片)、 生物傳感器技術和聚合酶鏈式反應技術， 并展望了其發展方向， 以期為后續研究提供參考和借鑒。

　　關鍵詞： 快速檢測; 酶抑制技術; 免疫學技術; 生物傳感器; 聚合酶鏈式反應

　　食品安全是國家的重大戰略需求。 我國的食品安全檢測于 2000 年左右開始興起， 至今已基本建成了食品質量安全保障體系和全過程監管體系， 逐步健全了安全標準體系， 重大食品安全風險得到控制。 然而， 由于農藥、 獸藥違規濫用等引發的農產品質量安全事件仍時有發生， 使消費者對食品安全缺乏信心。農產品質量安全檢測常用的是傳統實驗室大型儀器檢測方法。 隨著有關部門對農產品質量安全監管的重視， 安全抽檢任務日益加重; 而農產品流通交易時間較短， 數量較大， 傳統實驗室檢測周期長， 難以及時發現和控制問題， 因此對于農產品質量安全快速檢測方法的需求日益凸顯。

　　2015 年 10月 1 日起實施的新修訂的 《中華人民共和國食品安全法》， 對快速檢測方法的法律地位進行了調整，從初步篩查轉變為抽查檢測， 抽查檢測的結果確定不符合食品安全標準的， 可以直接作為行政處罰的依據[1]。相較于大型儀器檢測方法， 快速檢測方法樣品前處理簡單， 對設備要求不高， 分析方法簡便、 快速， 能在較短時間內完成， 尤其適用于現場快速檢測。 目前快速檢測方法的開發主要基于生物技術、光譜學技術、 化學技術等[2～5]， 本文主要介紹近年來基于生物技術的農產品質量安全快速檢測方法的開發、 研究現狀及應用情況， 并展望了未來的研究方向與發展趨勢。

　　一、 酶抑制技術

　　酶抑制技術是基于某些物質對酶的抑制作用而進行分析的方法， 主要應用于農產品中有機磷和氨基甲酸酯類農藥殘留的檢測， 常用的酶類包括膽堿酯酶和羧酸酯酶等， 具有簡單、 快速、 靈敏， 對儀器設備要求不高且應用范圍廣等優點。 YANG 等[6]建立了一種快速測定牛奶中有機磷和氨基甲酸酯類農藥殘留的酶抑制反應體系 ， 農藥的檢出限為0.5～1.0 mg/kg。 基于酶抑制技術的快速檢測方法，雖然存在準確度不高、 選擇性差、 時有干擾等局限性， 但依然是目前有機磷和氨基甲酸酯類農藥殘留快速檢測的主流方法。 研究人員也在嘗試利用多種方式， 優化酶抑制技術以提高其相關產品的性能。JIN 等[7]改進了乙酰膽堿酯酶抑制分析方法， 開發了一種通過有機溶劑萃取結合自發性原位溶劑蒸發的紙基微流控分析系統， 使其分析性能得到了顯著提高。

　　WU 等[8～9]將酶抑制技術與金納米材料有機結合開發了一種比色方法， 利用金顆粒在不同價態形式下呈現的顏色不同， 來指示有機磷農藥的濃度， 在最佳條件下， 觀察到的最小比色濃度為 0.7mg/L， 大大提高了檢測靈敏度。 QING 等[10]同樣采用了基于金納米材料的酶抑制技術， 建立了一種可快速檢測有機磷農藥的方法， 以三唑磷作為模型農藥 進 行 驗 證 ， 在 最 優 條 件 下 的 檢 測 限 為 4.69nmol/L。 這種利用金納米材料的高靈敏度， 對現有的酶抑制技術預處理方法進行改進優化的方法， 在未來有機磷農藥殘留的快速檢測領域有較為廣闊的應用前景[11]。

　　二、 免疫學技術

　　(一) 酶聯免疫吸附測定法

　　酶聯免疫吸附測定 (Enzyme linked immunosorbent assay， ELISA)法是目前常用的應用免疫學技術的方法之一， 其基本原理是充分利用了抗原-抗體結合的特異性和酶高效催化底物的特性， 通過酶作用后顯色的顏色深淺來達到定性或定量檢測樣品中待測物的目的[12]。ELISA 主要包括直接競爭法、 間接競爭法和雙抗夾心法等， 具有操作簡單、 相對成本低、 預處理速度快、 可以高通量分析等優點[13]。 ZHANG 等[14]建立了一步間接競爭 ELISA 法， 用于快速、 特異地檢測動物源性農產品中的地克珠利殘留， 可在 50 min內完成對樣品的分析。 LI 等[15]制備了特異性一致且親和力高的抗菌增效劑單克隆抗體， 并建立了間接競爭 ELISA 方法， 用于雞肉和牛奶中抗菌增效劑的 檢 測 ， 檢出限分別可達 0.06 ～0.8 μg/kg 和0.05～0.6 μg/L。

　　YANEVA 等[16]制備了抗敵敵畏和對氧磷的綿羊多克隆抗體， 并在此基礎上建立了間接競爭 ELISA 法， 用于生鮮乳中敵敵畏和對氧磷殘留的快速篩查。 間接競爭法需要使用酶標二抗，操作步驟相對復雜， 相比較而言直接競爭法更加快速便捷。 WU 等[17]建立了適用于氯霉素殘留檢測的直接競爭 ELISA 法， 通過方法學驗證及實際樣品檢測， 證明此方法具有足夠的靈敏度用于檢測農產品樣品中的氯霉素殘留。ELISA 法所使用的抗體， 包括通用抗體和廣譜抗體。 通用抗體的制備對于免疫原的設計要求較高， 且無法保證抗體對待測物具有一致的親和力;而廣譜抗體的制備， 雖然使用的是 “多半抗原策略”， 但所獲得的抗體對待測物親和力較低[18]。

　　因此， 基于抗原-抗體的 ELISA 方法存在一定的局限性， 需要開發更易獲取、 高效穩定、 特異性強的識別元件， 以彌補抗體制備技術的不足。 XIANG等[19]開發了一種基于適配體的 ELISA 方法， 將適配體的生物識別功能與酶信號放大功能相結合， 用于檢測蔬菜、 水果中的水胺硫磷， 檢測限為 0.05ng/mL， 靈敏度優于傳統的 ELISA 方 法。 WANG等[20]合成了一種分子印跡聚合物作為仿生抗體， 基于此開發了可用于檢測動物源性農產品中恩諾沙星的 ELISA 方法， 檢測限為 1.1 ng/mL， 結果與高效液相色譜法測定結果一致。 適配體和分子印跡聚合物作為新型識別元件， 具有制備快速簡單、 穩定性強、 特異性好、 易于保存等優點， 與 傳 統 ELISA方法結合， 可擴大檢測適用范圍。

　　(二) 免 疫 層 析 法

　　免 疫 層 析 (Immunochromatographicassay， ICA) 法是基于層析技術和 抗原-抗體特異性結合而發展起來的一項快速檢測技術， 具有操作簡單、 檢測速度快、 成本較低、 高通量等優點[21]。 其基本原理是將抗原或抗體固定在硝酸纖維素膜的檢測線上， 二抗固定在質控線上， 在毛細管層析作用下， 標記后的抗體與待測物隨樣本溶液在硝酸纖維素膜上流動， 并與檢測線及質控線上的抗原或抗體發生高特異性、 高親和性的免疫反應， 通過檢測區域標記抗體信號強弱的變化可對樣品中的待測物進行定性、 半定量以及定量檢測[22]。隨著科技的發展， 用于標記抗體的標記物的種類也呈現出多樣化發展， 包括膠體金、 熒光納米顆粒、 量子點、 上轉換發光顆粒等[23～26]。

　　其中， 膠體金是應用最為廣泛的抗體標記材料， 合成技術最為成熟， 是由氯金酸還原后聚合成的金顆粒形成帶負電的疏水膠溶液， 其顏色肉眼可見且穩定性高[22～23]，基于此開發的主要產品為膠體金免疫層析試紙條。如 WU 等[17]研發了可用于檢測食品樣品中氯霉素的免疫層析試紙條， 檢 測 限 為 0.5 ng/mL， 可 在 10min 內完成檢測。

　　GAO 等[27]研究建立了一種適用于檢測雞肉樣品中金剛烷的 ICA 方法， 并與 ELISA方法進行比較， 結果非常相似， 為現場快速檢測提供了一種有力工具�；�于傳統通用抗體的 ICA 方法在高通量檢測方面存在一定的局限性， 即一種產品只能檢測特定的一種參數。 近年來， 基于廣譜抗體的 ICA 方法開發逐漸成為研究重點， 其可用于同時檢測多種參數。 GUO 等[28]開發了一種可同時檢測雞胸肉中卡巴氧和喹賽多殘留的膠體金免疫層析試紙條， 檢測限分別為 2.92、 2.68 μg/kg， 并通過液相色譜-串聯質譜法進行了驗證。

　　HAN 等[29]研發了一種八聯側流免疫分析方法， 可同時對牛奶中喹諾酮類、 四環素類、 β-內酰胺類、 磺胺類、 氯霉素、 鏈霉素、黃曲霉毒素 M1 和三聚氰胺 8 類藥物殘留開展定性或半定量分析， 檢測時間< 20 min。 WANG 等[30]利用熒光納米顆粒標記的非特異性單克隆抗體建立了一種 ICA 方法， 可在 8 min 內快速篩查豬肉中 7 種β-激動劑， 檢測限<50 pg/g。 PENG 等[31]利用一種具有廣泛特異性的單克隆抗體， 開發了可同時檢測32 種喹諾酮類藥物的 ICA 方法， 檢出限為 0.1～10ng/mL。 然而， 受抗體親和性較低及成本較高的限制， 市售的此類檢測產品較少， 應用范圍不及傳統的 ICA 快速檢測產品。

　　(三) 生物芯片法

　　生物芯片法是 以 硅 芯 片、玻璃芯片或高分子聚合物薄片為載體， 利用 DNA或蛋白質等生物大分子間特異性的相互作用對目標分子進行快速檢測的方法， 可實現對單一樣品中多種待測物的同時檢測， 主要包括免疫芯片法、 基因芯片法、 細胞芯片法等[32]。 LI 等[33]采用可視化微陣列技術開發出了一種同時檢測牛奶中三聚氰胺、 頭孢氨芐和黃曲霉毒素 M1 的多殘留檢測技術， 檢測限分別為 16.31、 8.21、 0.21 ng/mL。

　　LAN 等[34]研發了一種可同時檢測 7 種農藥 (三唑磷、 甲基對硫磷、 甲氰菊酯、 呋喃丹、 噻蟲啉、 百菌清和多菌靈) 的生物芯片， 檢測限為 0.02～6.45 ng/mL。 趙穎等[35]建立了一種可同時檢測農產品中毒死蜱等10 種農藥多殘留的免疫芯片方法 ， 檢 測 限 可 達1.49～15.72 μg/L， 檢測過程僅需 1.5 h， 具有良好的實用價值。 由于生物芯片法具有高通量、 高效率的特性， 已成為一種很有前景的農產品中危害物質殘留檢測的工具[18]。 然而， 受限于生物芯片的制備工藝， 在樣品檢測分析中較難獲得對不同待測物的良好靈敏度， 且易于與其他類似物質發生交叉反應， 因此在實際應用中尚未得到廣泛應用。

　　三、 生物傳感器技術

　　根據國際純粹與應用化學聯合會 (InternationalUnion of Pure and Applied Chemistry， IUPAC)的定義， 生物傳感器是指能夠將生物體內分離的酶、 組織、 免疫系統、 細胞等介導的生化反應轉化為電、 熱或光信號， 并通過信號的變化來檢測目標化合物的設備[36]。 生物傳感器分為生物識別和信號轉導兩部分， 根據信號轉導方式的不同， 可分為光學生物傳感器、 化學生物傳感器、 機械生物傳感器等[2]。 使用生物傳感器進行農產品質量安全檢測，樣品不需要進行復雜前處理， 靈敏度高、 選擇性好， 適用于農藥殘留、 獸藥殘留及微生物的現場快速檢測。 STEVENSON 等[37]開發了一種用于檢測肉類樣品中頭孢噻呋殘留的電化學生物傳感器方法，可以在 15 min 內完成檢測， 在火雞肉樣品中的檢測限為 10 ng/mL。

　　近年來， 隨著多種新型生物識別元件和轉導技術在生物傳感器開發中的應用， 使得生物傳感器性能不斷提高， 逐漸向小型化、 便攜化方向發展。 其中， 基于納米技術開發的生物傳感器的研究最為廣泛， 在提高檢測可靠性和靈敏度方面發揮著重要作用[38～39]。 JIN 等[40]研究制備了一種基于超順磁性納米顆粒的生物傳感器， 并將其應用于牛奶樣品中的沙 門 氏 菌 檢 測， 可 在 2 h 內 準 確 檢 測 到 低 至 104CFU/mL 的沙門氏菌。

　　LIN 等[41]報道了一種基于碳納米顆粒的適配體生物傳感器， 具有超靈敏和高選擇特性， 用于牛奶中卡那霉素殘留的快速檢測， 檢測限均<5.0×10-8 ng/mL。 MA 等[42]合成了鉑納米粒子錨定鋯基金屬有機骨架的納米復合材料， 并基于此制備了用于蔬菜水果中有機磷農藥殘留檢測的乙酰膽堿酯酶生物傳感器， 其檢測馬拉硫磷的檢測限為 4.9×10-15 mol/L。 此外， 基于適配體的生物傳感器的設計， 也為實現農產品中污染物的現場快速檢測提供了一種有應用前景的手段[43～44]。盡管有多種不同方法的融合為生物傳感器領域帶來了新的機遇， 但由于農產品樣品本身的基質復雜性， 一定程度上阻礙了其向更高特異性和靈敏度方向的發展， 還需要進一步研究以提高該技術的性能， 以克服實際應用中的挑戰[45]。

　　四、 聚合酶鏈式反應技術

　　聚合酶鏈式反應 (Polymerase chain reactions，PCR) 技術是一種可對特定基因片段進行放大擴增的分子生物學技術， 具有靈敏度高、 特異性強等優點。

　　近 年 來 ， 隨著多學科交叉研究的發展 ， 以PCR 技術及其衍生技術為代表的分子生物學技術，逐漸被應用于農產品質量安全快速檢測領域， 特別是用于品種溯源、 真偽鑒別、 轉基因檢測、 病原微生物測定等方面[46～51]。常 用 的 PCR 技術主要包括直接 PCR、 多 重PCR (Multiplex PCR)、 重組酶聚合酶擴增 (Recombinasepolymerase amplification， RPA) 、 實 時熒 光 定 量 PCR (R eal-time fluorogenic quantitativePCR， RT-PCR)、 環介導等溫擴增 (Loop-mediatedisothermal amplification， LAMP) 等[52～55]。 其中，應用最為廣泛的為 RT-PCR。

　　相較于傳統的直接PCR， RT-PCR 不需要進行凝膠電泳等后續分析過程， 而是依靠熒光信號實時監測擴增子拷貝數的增加， 從而達到實時檢測的目的[54]。 TAN 等[46]建立了一種 SYBR Green 定量聚合酶鏈式反應方法， 用于肉制品中豬肉摻假的快速檢測。 該方法以家豬基因組中特異性的重復 LINE-1 基因為目標片段， 同時改進了基因組 DNA 的提取效率， 并驗證了方法的特異性、 靈敏度 (0.001% w/w) 和穩健性。

　　WAN等[48]利用綠色飽和熒光染料構建了兩種快速檢測沙門氏菌的 RT-PCR 體系， 并采用石墨烯量子點作為放大系統， 以增強方法的特異性。 通過實際樣品驗證， 該方法陽性檢出率更高， 所需時間更短， 適用于即食水果和蔬菜中沙門氏菌的檢測。 LI 等[51]開發了一種針對 IE034 轉基因玉米的 RT-PCR 定量檢測方法， 根據插入序列與玉米側翼基因組序列的5' 端連接， 設計了 134 bp 的擴增子。 通過實際樣本 檢 測 驗 證 ， 該方法適用于植物源性農產品中IE034 轉基因成分的特征識別、 風險評估及有效監測。

　　我國也已出臺多項國家標準及行業標準， 對于RT-PCR 方法的特異性、 準確性予以肯定[56～58]。盡管 PCR 技術在農產品質量安全快速檢測領域發展較為迅速， 但由于方法本身存在的局限性(如易出現假陽性、 儀器成本較高等)， 在實際應用中仍存在較多需要解決的問題。 隨著儀器和材料技術的不斷改進， 將 PCR 技術與新型材料 (如量子點、 納米顆粒等) 相結合以進一步提高檢測的靈敏度、 降低檢測成本， 可作為未來發展的方向。

　　五、 展望

　　基于不同生物技術開發的農產品質量安全快速檢測方法種類較多， 且優缺點各異。 應用于實際檢測工作時， 可根據不同的檢測樣品及檢測需求選擇合適的方法及相關產品。隨著快速檢測在食品安全監管系統中所占比重逐漸增大， 對于快速檢測技術及相關儀器、 產品的要求也逐漸提高。 然而， 目前的快速檢測方法多為定性或半定量分析， 如何在準確定量分析方面有所突破， 將是科研人員未來的研究重點。

　　此外， 目前市售的快速檢測產品， 尚無統一的評價標準。 國家市場監督管理總局于 2021 年 4 月發布了 “關于公開征求 《關于規范食品快速檢測使用的意見 (征求意見稿)》 意見的公告”， 以期規范食品快速檢測的使用。 劉海虹等[59]在借鑒國內外相關的檢測方法和產品評價技術的基礎上， 研究制定了食品快速檢測產品評價技術規范， 并在廣東省進行了應用驗證，為建立符合我國實際情況的食品快速檢測產品評價體系積累了經驗; 羅俊霞等[60]分別以 “ELISA 快速檢測”“膠體金 ICA 快速檢測”和“酶抑制-比色法快速檢測” 3 類試劑盒為例， 根據其各自的特征和檢測目的， 初步探索和研究了不同的快速檢測試劑盒評價方法， 對我國農產品質量安全檢測試劑盒的評價工作起到了一定的參考作用。綜上所述， 無論是更加準確、 靈敏的快速檢測技術方法的研發， 還是快速檢測產品評價體系的建立， 都將是今后農產品質量安全快速檢測領域發展的方向。

　　參考文獻

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　　作者：侯 薔 郝立武 張書宏 周 鑫 張 誼 鄭百芹

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